稳转细胞株的构建

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稳转细胞株的构建

2016-01-21

问题描述：

现在准备构建两株细胞的稳转细胞系，进行了一点实验，其中一株细胞在筛选过程中几乎都死光了，另一株目前还好，有几个问题想请教一下园子里的高手，还请给位给点建议。
G418浓度之前师兄已经摸索出来，这次筛选直接用师兄浓度。
1、6孔板转染后多长时间开始进行G418筛选？
2、G418筛选是在6孔板中继续筛选还是转到24/96孔？大皿？
3、G418浓度什么时候减量
4、？筛选过程中荧光观察一小部分克隆不错，如何挑选出来？
5、整个筛选过程大约需要多长时间？
lipo3000筛选
谢谢大家！

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l小呆

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自己顶一下，园子里的高手们发表点建议啊。。。

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shylook

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展开引用l小呆现在准备构建两株细胞的稳转细胞系，进行了一点实验，其中一株细胞在筛选过程中几乎都死光了，另一株目前还好，有几个问题想请教一下园子里的高手，还请给位给点建议。G418浓度之前师兄已经摸索出来，这次筛选直接用师兄浓度。1、6孔板转染后多长时间开始进行G418筛选？2、G418筛选是在6孔板中继续筛选还是转到24/96孔？大皿？3、G418浓度什么时候减量4、？筛选过程中荧光观察一小部分克隆不错，如何挑选出来？5、整个筛选过程大约需要多长时间？lipo3000筛选谢谢大家！......1转染后48-72小时筛选2大皿好挑单克隆，但我们以前用瓶子筛不容易污染3挑出阳性克隆前不减量量你要做个梯度筛选啊！4用枪头或者灭菌后牙签5技术成熟的话1-2个月左右你也可以做有限稀释法就不需要挑！当然做慢病毒最快只要1周就搞定！

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l小呆

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展开引用shylook1转染后48-72小时筛选2大皿好挑单克隆，但我们以前用瓶子筛不容易污染3挑出阳性克隆前不减量量你要做个梯度筛选啊！4用枪头或者灭菌后牙签5技术成熟的话1-2个月左右你也可以做有限稀释法就不需要挑！当然做慢病毒最快只要1周就搞定！......谢谢回复！G418浓度梯度师兄之前已经做好了。您6孔板转大皿或培养瓶比例是几比几？是在显微镜下观察好一片荧光区域，用枪头画出来吗？另外加胰酶消化的话会分散，不能固定在划线区域，您有什么好办法吗？谢谢！

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shylook

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展开引用l小呆谢谢回复！G418浓度梯度师兄之前已经做好了。您6孔板转大皿或培养瓶比例是几比几？是在显微镜下观察好一片荧光区域，用枪头画出来吗？另外加胰酶消化的话会分散，不能固定在划线区域，您有什么好办法吗？谢谢！......转染后48小时以上转染肯定是常规比率了转染后按形成单细胞的比率铺板加药

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l小呆

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shylook转染后48小时以上转染肯定是常规比率了转染后按形成单细胞的比率铺板加药谢谢，那您挑单克隆的方法可以说的详细一点吗？

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293bbs

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为啥不直接用慢病毒？G418筛选也是个吃力不讨好的方法！欢迎来我的细胞转染，病毒包装精华贴求助，帖子链接:腺相关病毒包装（AAV）、慢病毒包装、腺病毒包装、细胞转染、病毒在体转染【技术答疑】（精华贴-吐血长期在线解答）战友们，点击投票助本贴上蚂蚁淘首页咯！-蚂蚁淘论坛