同位素标记磷酸化蛋白质组学（Phosphoproteomics）技术服务

简介

磷酸化是生物体内存在最为广泛的一种蛋白质翻译后修饰，可以发生在约1/3以上的蛋白质中，对各种细胞过程和生命活动如信号转导和细胞周期等起着重要的调节作用。蛋白质磷酸化参与调节细胞多种生命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢等。因此，分析蛋白质磷酸化修饰在不同生理病理状态下的相对量的变化，可进一步发掘与疾病发生发展相关的重要生物标志物，为揭示其分子机理奠定基础。

技术原理

同位素标记磷酸化蛋白质组学（Phosphoproteomics）技术通过巧妙的将iTRAQ标记试剂与磷酸化肽段高效富集相互结合来达到对磷酸化肽段（蛋白质）同时进行定性和定量的目的。在本实验中，经过蛋白质提取（ProteinExtract）获得组织细胞中的全蛋白，全蛋白在胰酶作用下被酶解（TrypsinDigestion）成肽段，iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记。标记混合之后的肽段经过富集得到磷酸化肽段。

目前，固相金属离子亲和层析法（IMAC），强阳离子交换色谱法（SCX），金属氧化物亲和色谱法以及抗体法是几种常用的磷酸化肽段分离和富集方法。本实验将选用操作简单，富集效率高的二氧化钛（TiO2）进行磷酸化肽段的富集。TiO2富集法是目前最为成熟的金属氧化物富集法。TiO2在不同的pH值下，可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合；在碱性条件下，则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。这样磷酸化肽段的磷酸基在酸性条件下与之结合，碱性条件下洗脱达到富集磷酸化肽段的目的。

技术特点

• 全面性

磷酸化蛋白质组学以整个细胞所有蛋白为研究对象，研究内容囊括了细胞内所有具有生命功能的蛋白，如细胞增生、细胞分裂和细胞分化等所有相关蛋白，因而研究更为全面。

• 可靠性

传统的经典生物学研究蛋白质磷酸化往往针对特定条件，以两个或更多蛋白质之间的相互作用为出发点，具有相当局限性，缺乏整体认识。磷酸化蛋白质组学则可一次性全面检测不同蛋白激酶及磷酸化酶对同一个蛋白磷酸化程度的影响，因而结果更加普遍性和可靠性。

• 高效性

磷酸化蛋白质组学反映的是细胞内真实发生的事件，在一次试验中考虑了各种变量，克服了经典生物学中逐步添加变量的缺陷，更为高效。

• 探索性

磷酸化蛋白质组学以细胞内全部蛋白质为研究对象，相对于传统的生物学研究以及蛋白质芯片，更易发现未知的新磷酸化位点和磷酸化蛋白质。如果可以联合经典生物学技术，则可以发现新的具有磷酸化或者去磷酸化功能的酶。

样品要求

1.最好送原始样本，除非客户有成熟的蛋白质组学的蛋白提取方法。

2. 动物组织样品：湿重不少于200mg，样品不能溶血，取材后用PBS冲洗3遍去除血液。

3. 植物组织样品：湿重不少于1g，取材后用PBS冲洗3遍去除杂质污染。

4. 菌体样品：原则上只接受常见无毒菌的菌体样品，菌体沉淀不少于100mg或者体积不少于100μL；若为含有毒菌的菌体样品或菌体　裂解液，按照《病原微生物技术服务操作指南》执行。

5. 细胞样品：收集细胞沉淀，PBS冲洗3遍，送样量为5×106或细胞沉淀不少于50μL。

6. 培养基上清液：需保证无菌体或细胞（用0.2μm膜过滤），有条件的话可浓缩后再寄送；送样体积不少于10ml。

7. 血清样品：新鲜血液取出后，4℃，2000g，离心15min，取上清，即得血清；血清制备过程中保证不能溶血；血清体积要求不少于500μl；制备血清过程中，客户可根据自己的样品和实验要求选择是否添加抗凝剂，一般不用添加。

8.若客户直接提供蛋白，则蛋白量不少于1mg，浓度不低于2mg/mL。

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