二苯胺法测定DNA含量【实验目的】掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法【实验原理】DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解,产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸,后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物,其反应如下图。蓝色化合物在595nm处有最大吸收,且DNA在40µg~400µg范围内时,吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。【实验材料】1.实验器材恒温水浴,721分光光度计。2.实验试剂(1)DNA标准溶液:准确称取小牛胸腺DNA10mg,以0.1mol/LNaOH溶液溶解,转移至50ml容量瓶中,用0.1mol/LNaOH溶液稀释至刻度。浓度为200µg/m1;(2)DNA样品液:用上述实验方法提取的DNA样品(3)二苯胺试剂:使用前称取1g结晶二苯胺,溶于100m1分析纯冰醋酸中,加60%过氯酸10m1混匀。临用前加入1m11.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。【实验操作】1.标准曲线的绘制取干燥试管6支,编号,按表所示加入试剂。试剂管号012345DNA标准溶液,ml0.00.40.81.21.62.0蒸馏水,ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂,ml4.04.04.04.04.04.0A595加完毕,混匀,于60℃恒温水浴中保温1h,冷却后于595nm处测定吸光度,以零号管作对照,绘制标准曲线。2.样品测定取试管3支,两支为样品管,—支为对照管。对照管操作与标准曲线零号管相同。向每支样品管中加入2m1样品液及4ml二苯胺试剂,60℃保温1h,冷却后于595nm测定吸光度,以对照管调零点。根据测得的吸光度,从标准曲线上查出相应吸光度的DNA含量。【实验结果讨论】1.该反应灵敏度较低,但方法简便,目前仍广泛使用。2.其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等,对此反应由干扰,测定前应尽量除去。