培养细胞染色体显示法实验一传代培养细胞染色体显示法
| 实验方法原理 | 培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和制出标本清晰度高等优点，是制备染色体极好的对象。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | HanksNaHCO3培养基血清秋水仙素 仪器、耗材 | 酒精灯镊子培养瓶吸管离心管 实验步骤 | 1. 培养细胞 取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%～90%汇合单层培养细胞； 2. 加秋水仙素 使用最终浓度为0.02～0.8μg/ml营养液；温箱继续培养6～10 小时； 或用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下6～12小时后，再于37℃温箱中继续培养6～10小时处理（加秋水仙素）； 3. 采集分裂细胞 可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲涮；应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察； 4. 离心 收集培养液，1000转/分钟，离心5～10分钟； 5. 低渗处理 吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液，在温箱中静置20～30分钟； 6. 预固定 向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀；此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块； 7. 固定 离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5～10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15～20分钟； 8. 重复7，末次离心后，小心吸除大部上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～1ml； 9. 制片 用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储存备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1张，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液（如固定液不散，可能因载物片未洗净或不冷所致），滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用（做显带或荧光观察等）或立即进行染色观察； 10. 染色和封片 一般常用Giemsa染色；取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察（适用油浸镜）；如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片（或先迅速过丙酮两次，每次30秒）后，再过二甲苯，然后封片亦可。  其他 | 一、讨论 1. 染色体制备过程是既易又难的方法；易在要求条件简单、操作不复杂繁锁，易于获得结果。 2. 难在制备出的标本不总是非常理想和一致，常出现分裂相数少、染色体分散不良、或染色体过短等，为此在初做时，应试做预试验，摸清诸条件，能提高成功率。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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