目的基因在真核系统中的表达及细胞内的定位实验一磷酸钙法瞬时转染法
| 实验方法原理 | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 真核细胞 试剂、试剂盒 | HBSCaCl2TE质粒DNA 仪器、耗材 | CO2培养箱 实验步骤 | 1. 转染的前一天在35mm培养皿中植入细胞（约1×106个细胞），使得第二天转染时细胞汇合率达到50-80%； 3. 在1.5ml无菌的离心管中混合下列药品： 15.5μl2MCaCl2，最多10μg质粒DNA，补加TE(pH8.0)至125μl； 4. 在无菌的35mm平皿中加入125μl2×HBS(pH7.10)，然后逐滴加入上述混合物，一边加一边充分混合，使磷酸钙沉淀均匀，室温放置20分钟，这时溶液将有非常小的磷酸钙沉淀颗粒形成； 5. 20分钟后，将混合物加入细胞中，37℃培养箱中培养4-8小时； 6. 4-8小时后，用含血清的完全培养基替换旧培养基，37℃培养箱中继续培养； 7. 在转染后24-72小时将细胞置于荧光显微镜下观察目的蛋白的表达。 注意事项 | 1. 所有操作都必须在无菌条件下进行； 2. 2×HBS、2MCaCl2和TE须经0.22μm滤器滤菌分装后使用； 3. 沉淀的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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