| 实验步骤 | 制备VSV-G结合物并用于基因传递材料试剂 BCA蛋白质定量试剂盒（Pierce，Rockford,Illinois) 细胞培养基 HEK293细胞（ATCC) 质粒 报道基因表达质粒（如EGFP-Nl，BDBiosciences，PaloAlto，California) VSV-G表达质粒pHCMV-G(Yeeetal.1994a,b) Polybrene(4mg/ml储液） SDS——PAGE和银染试剂 Westernblot分析试剂 受体细胞 蔗糖（20%)/PBS 仪器 离心机，配备SW28转子和离心管（Beckman) SDS-PAGE和银染设备 Westernblot分析设备 微孔滤膜（〇.45um) 细胞板（6孔） 组织培养皿（IOcm) 37°C水浴 方法 制备VSV-G 任何转染方法都可以把VSV-G表达质粒转人到细胞中，以表达VSV-G蛋白。我们一般选用HEK293细胞系，因为它可以用包括CaP〇4_DNA共沉淀在内的任何方法进行转染，而且都具有高的转染（Yeeetal.1994a，b)。 1•转染24h前，在IOcm培养皿中，用合适的培养液，以大约7〇%的细胞密度接种HEK293细胞，生长过夜。 在转染时，细胞密度应该达到90%〜100%。 2•用标准的CaPCVDNA共沉淀方法转染1〇〜2〇ug的PHCMV-G质粒到HEK293细胞。 因为HEK293细胞对CaPO4沉淀的毒性敏感，所以转染时间应短于8h。 3.第二天，更换新鲜培养液。 因为VSV-G的融合作用，可能形成的多核体，但在这一时间应该还不明显。继续培养过夜。 4.此时多核体应该非常明显。收集培养液，0.45um滤膜过滤，一70°C储存。加人新鲜培养液到细胞中，并继续培养过夜。 5.许多细胞可能飘浮起来，收集培养液，同步骤4过滤。一70°C储存或进行纯化。 部分纯化VSV-G(简单方法） 6.部分纯化VSV-G，步骤如下： b.低速离心除去不溶性碎片（如4°C，3000r/min离心lOmin)。把上清加到20%的蔗糖/PBS(5ml)中，置入SW28转子的离心管中，用PBS覆盖并填满离心管，25000r/min离心6h或过夜。弃上清，用100〜20(V1PBS重悬沉淀。 c.用BCA蛋白质定量试剂盒测量VSV-G蛋白的浓度。蛋白质纯度经SD&PAGE、银染和Westernblot分析估计，使用抗-VSV-G单克隆抗体P5D4。 用VSV-G转染 7.转染前24h，在6孔板中，用合适的培养基接种待转染细胞，培养过夜 8•减少孔中的培养液至每孔lml,加人POlybrene到培养液中（4ug/ml)。在一个小离心管中，将2〜5ug的质粒DNA(如PEGFP-N1)和10ul大约1ug的VSV-G溶液混合。将其快速加人到细胞中。 9•混匀，置入培养箱中培养2〜6h，然后每孔补加Iml新鲜培养基，继续培养。如果碎片较多，洗涤细胞并加2ml新鲜培养基。 10•在1〜3d，测量转基因表达，以评估细胞的转染效率 |
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