Product Information
The BIP-300 plasmid allows you to compare your pAN or pAC AviTagTM fusion gene"s protein expression against a confirmed AviTagTM fusion product under the same growth and induction conditions. When transformed into the same E. coli host strain as your own pAN or pAC AviTagTM fusion plasmid construct, and induced in parallel, the BIP-300 Positive Control Plasmid will provide a measure by which to compare your transformation efficiency, growth and antibiotic maintenance conditions, and induction of your plasmid"s gene-fusion construct. The BIP-300 construct consists of a modified β-galactosidase gene (8 amino acids were deleted from its N-terminus) cloned into Avidity"s pAN5 AviTagTM fusion vector at the Multiple Cloning Site. The resulting AviTagTM-protein fusion (AviTag-β-gal), as are all the pAN and pAC fusion products, is under the tight control of the Trc promoter system and expressed upon IPTG induction. The plasmid is maintained with ampicillin. An example induction protocol is given under Protocols. This protocol uses the Avidity AVB101 E. coli strain containing the BirA over-expressing pACYC-184 plasmid construct (pBirAcm) as the host strain. It is initially requires chloramphenicol for maintenance in addition to the ampicillin required to maintain the pAN or pAC plasmid construct. If you are using a different host strain please adjust the protocol accordingly.
Supplied as 1 vial of Positive Control Plasmid DNA; 2µg at 1mg/mL in nuclease-free water (2µL). Store at -20°C.Avidity是一家开创抗体寡核苷酸结合(AOC)的公司。™)AOCs结合了单克隆抗体的组织选择性和基于寡核苷酸的治疗方法的精确性,以克服寡核苷酸传递的障碍和疾病的目标遗传驱动因素。它们的AOC平台,演示了疾病相关RNA在细胞类型和组织中的调节,包括肌肉、心脏、肝脏、肿瘤和免疫细胞。专有的平台技术可以在单一抗体支架上传递多种治疗性寡核苷酸。AOCs具有类似于抗体的药物性质,并允许将寡核苷酸有效载荷传递到其他运载平台所不提供的非肝组织。AOC也有其独特之处,因为可以处理不可药物的目标。 它们正在推进一系列的治疗计划,重点是罕见的肌肉疾病和其他严重疾病。主要项目是开发治疗杜氏肌营养不良和肌营养不良患者的治疗方法。还与制药合作伙伴合作开展项目。并得到了经验丰富的团队和受人尊敬的生命科学投资者的支持。
带有AviTag标签的人类全长ORF克隆已经被构建在多种T7和CMV启动子表达系统,可以立即购买使用。AviTag标签蛋白可以被体内或体外的生物素连接酶生物素化,而且抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合,正基于这两个反应,AviTag™技术可以应用于蛋白的固定,纯化和显影。虽然Avidity是一个小公司,科学带来的好处及其AviTag已得到认可。目前,AviTag技术已经在22个国家的世界十 大制药公司和研究人员中得到认可。
Avidity带有AviTag标签的人类全长ORF克隆已经被构建在多种T7和CMV启动子表达系统,可以立即购买使用。AviTag标签蛋白可以被体内或体外的生物素连接酶生物素化,而且抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合,正基于这两个反应,AviTag技术可以应用于蛋白的固定,纯化和显影。 Avitag™技术 亲合力开发和销售用于连接分子的分子亲和力工具。我们的zhuan利AviTag™技术采用来自大肠杆菌的生物素连接酶(BirA),在独特的15氨基酸肽标签上使用单一生物素的高度靶向酶促缀合。AviTag™序列是GLNDIFEAQKIEWHE。以链霉抗生物素蛋白包被的表面为导向,这为分子结合相互作用创造了理想的表现形式。 avidity的AviTag技术的科学优势引起了人们的注意。目前,AviTag技术已被全球十大制药公司中的七家授权,并被22个国家的研究人员使用。 Avidity公司历史 avidity LLC由Millard Cull,Larry Lansing,Ron Gill博士和Mark Seville博士于1996年创立,根据生物素对抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的非凡亲和力开发肽标签和分子生物学产品。在Affymax担任研究员期间,Millard参与了AviTag技术的发现,发现了其商业潜力,并获得了Affymax的*权利。他创建了avidity作为试剂公司,将AviTag技术的使用权转让给其他公司,并销售与该技术一起使用的产品。 AviTag历史 AviTag是一种获得zhuan利的生物素标记技术,由Affymax博士在Peter Schatz博士的“定向进化”方法中发现,称为“质粒上的肽”。定向进化方法鉴定了许多可被大肠杆菌的BirA酶生物素化的肽序列,这些序列中蕞 好的被称为AviTag。大肠杆菌酶BirA将15个氨基酸的AviTag生物素化为其天然底物生物素羧基载体蛋白(BCCP)的两倍。 使用AviTag技术的蛋白质的酶促生物素化优于蛋白质的化学生物素化,因为BirA酶温和且高度特异性地标记AviTag的赖氨酸残基。在AviTag之前,最小的生物素接受结构域由75个氨基酸组成。
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1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 – 90 %致密度。
2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3. 注意冷冻保护剂之品质,冻存液:10%DMSO+90%FBS,我做细胞试验从不加双抗,NAHCO3-未加
4. 冷冻保存的细胞浓度:
冻存方法
1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
2.收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 离心速度不要大于1000rpm/min或800g/min。
3.离心弃上清,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml,混匀,分装于无菌冻存管中,1 ml/vial,悬浮细胞可以浓一些。
4.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。 或4 oC 1h→ -20 oC 1h→ -80 oC 1h(或隔夜) → 液氮槽vapor phase
最常见的我的k562细胞就是这样做的。
阳离子脂质体法 :稳定转染,瞬时转染,所有细胞使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率,但在体内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,这在很大程度上限制了其应用。
阳离子聚合物 :稳定转染,瞬时转染,所有细胞。除了具有阳离子脂质体的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内,转染效率高,细胞毒性低等特点,是新一代的转染试剂。
一、细胞冷冻保存
1.材料:
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法:
(1)传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤:
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
4、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度:
①normalhumanfibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④othersUSPensions:5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤:
(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理:
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。
2、材料:
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);Erythosinbluishstain;取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
3、步骤:
(1)取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例:
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;
细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;
细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
存活率:225/243﹦92.6%
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