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Addgene/pAAV-hSyn-GRAB_NE1h/1unit/123309-AAVrg
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| Item | Catalog # | Description | Quantity | Price (USD) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Plasmid | 123309 | Standard format: Plasmid sent in bacteria as agar stab | 1 | $75 | Add to Cart | |
| AAV9 | 123309-AAV9 | Virus (100 µL at titer ≥ 1×10¹³ vg/mL)and Plasmid.More Information | Add to Cart | |||
| AAV Retrograde | 123309-AAVrg | Virus (100 µL at titer ≥ 7×10¹² vg/mL)and Plasmid.More Information | Add to Cart | |||
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Backbone
- Vector backbonepAAV vector(Search Vector Database)
- Backbone sizew/o insert(bp)4495
- Vector typeAAV
Growth in Bacteria
- Bacterial Resistance(s)Ampicillin
- Growth Temperature37°C
- Growth Strain(s)NEB Stable
- Copy numberHigh Copy
Gene/Insert
- Gene/Insert nameGPCR activation based NE sensor GRAB_NE1h
- SpeciesH. sapiens (human)
- Insert Size (bp)1998
- PromoterhSyn
Cloning Information
- Cloning methodGibson Cloning
Resource Information
- Supplemental Documents
- pAAV-hsyn-GRAB-NE1h addgene.gb
- Terms and Licenses
- UBMTA
- Industry Terms
- Not Available to Industry
Depositor Comments
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Information for AAV9 (Catalog # 123309-AAV9)(Back to top)
Purpose
Ready-to-use AAV9 particles produced from pAAV-hSyn-GRAB_NE1h (#123309). In addition to the viral particles, you will also receive purified pAAV-hSyn-GRAB_NE1h plasmid DNA.
hSyn-driven expression of GRAB-NE1h norepinephrine sensor in neurons. These AAV preparations are suitable purity for injection into animals.Delivery
- Volume100 µL
- Titer≥ 1×10¹³ vg/mL
- Pricing$350 USD for preparation of 100 µL virus + $30 USD for plasmid.
- StorageStore at -80℃. Thaw just before use and keep on ice.
- ShipmentViral particles are shipped frozen on dry ice. Plasmid DNA (≥ 200ng) will also be included in the shipment.
Viral Production & Use
- Packaging Plasmidsencode adenoviral helper sequences and AAV rep gene, AAV9 cap gene
- BufferPBS + 0.001% Pluronic F-68
- SerotypeAAV9
- PurificationIodixanol gradient ultracentrifugation
Biosafety
Requestor is responsible for compliance withtheir institution"s biosafety regulations.Lentivirus is generally considered BSL-2. AAV isgenerally considered BSL-1, but may requireBSL-2 handling depending on the insert.Biosafety Guide
Resource Information
- Terms and Licenses
- Ancillary Agreement for Penn Vectors
- Terms of Use for Viral Vectors
- Industry Terms
- Not Available to Industry
Viral Quality Control
Quality Control:
- Addgene ensures high quality viral vectors by optimizing and standardizing production protocols and performing rigorous quality control (QC) (see a list of our QC assays). Thespecific QC assays performed varies for each viral lot. To learn which specific QC assays were performed on your lot, please contact us.
- Titer: the exact titer of your sample will be reported on the tube. The titer you see listed on this page is the guaranteed minimum titer. See how titers are measured.
Visit our viral production page for moreinformation.
Information for AAV Retrograde (Catalog # 123309-AAVrg)(Back to top)
Purpose
Ready-to-use AAV Retrograde particles produced from pAAV-hSyn-GRAB_NE1h (#123309). In addition to the viral particles, you will also receive purified pAAV-hSyn-GRAB_NE1h plasmid DNA.
hSyn-driven expression of GRAB-NE1h norepinephrine sensor in neurons. These AAV were produced with a retrograde serotype, which permits retrograde access to projection neurons. These AAV preparations are suitable purity for injection into animals.Delivery
- Volume100 µL
- Titer≥ 7×10¹² vg/mL
- Pricing$350 USD for preparation of 100 µL virus + $30 USD for plasmid.
- StorageStore at -80℃. Thaw just before use and keep on ice.
- ShipmentViral particles are shipped frozen on dry ice. Plasmid DNA (≥ 200ng) will also be included in the shipment.
Viral Production & Use
- Packaging Plasmidsencode adenoviral helper sequences and AAV rep gene, AAV retrograde cap gene from rAAV2-retro helper (plasmid #81070)
- BufferPBS + 0.001% Pluronic F-68 + 200 mM NaCl
- SerotypeAAV retrograde (AAVrg)
- PurificationIodixanol gradient ultracentrifugation
Biosafety
Requestor is responsible for compliance withtheir institution"s biosafety regulations.Lentivirus is generally considered BSL-2. AAV isgenerally considered BSL-1, but may requireBSL-2 handling depending on the insert.Biosafety Guide
Resource Information
- Terms and Licenses
- Terms of Use for Viral Vectors
- Industry Terms
- Not Available to Industry
Viral Quality Control
Quality Control:
- Addgene ensures high quality viral vectors by optimizing and standardizing production protocols and performing rigorous quality control (QC) (see a list of our QC assays). Thespecific QC assays performed varies for each viral lot. To learn which specific QC assays were performed on your lot, please contact us.
- Titer: the exact titer of your sample will be reported on the tube. The titer you see listed on this page is the guaranteed minimum titer. See how titers are measured.
Visit our viral production page for moreinformation.
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Retrograde functionality is dependent on high viral titers. Addgene recommends not diluting your AAV preps prior to use.蚂蚁淘电商平台
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蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
该平台由多位经验丰富的生物人和IT人负责运营。蚂蚁淘B2B模式是指客户有采购意向后在蚂蚁
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运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
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2021-09-01
简单的样品制备，分析成本低 ViroCyt TM2100病毒计数仪采用通用的核酸和蛋白染料对病毒染色，整个分析过程耗费少，无需免疫法中昂贵的抗体费用，每个样品的分析成本是免疫法的1/1000。 ViroCyt TM2100病毒计数仪采用结合了靶标才产生荧光的混合染料对病毒衣壳蛋白和核酸分别染色分析，无需洗涤步骤消除游离的荧光染料，无背景信号的干扰，简化了样品的制备过程。 样品制 查看更多
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2021-09-06
漩涡流量变送器，有优点是功能强、流量范围宽等，应用于石油、化工、电力。... 查看更多
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2021-09-05
MixPlus旋涡振荡器主要适用于医学、生物工程、化学、医药等研究领域，是生物实验室对各种试剂、溶液、化学物质进行固定、振荡、混匀处理的必备常规仪器... 查看更多
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2021-09-18
测控技术与仪器专业是信息科学技术的源头，是光学、精密机械、电子、电力、自动控制、信号处理、计算机与信息技术多学科互相渗透而形成的一门高新技术密集型综合学科。它的专业面广，小到生产过程自动控制，大到火箭卫星的发射及监控。很多同学认为这属于制造业，实际上由于对自动控制及... 查看更多
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2021-08-29
产品说明：该款经济型旋涡混匀器用途广，配置橡胶件工作盘和塑件工作盘两种。适用于不同试管，烧瓶，烧杯内的液体混匀。三点开关工作模式使得混匀器可以点动或连续工作。两种方式的速度可以根据需要调整。高效率。低 查看更多
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2021-09-16
[db:简介] 查看更多
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2021-09-02
近日 Medscape 儿科频道总结了 2014 年 Medscape 上点击率最高的 5 篇文章。这 5 篇文章为什么最受欢迎？他们分别讲了哪些内容？下面我们将一一道来。Top5：脑震荡后让大脑休息一下“认知休息”是否能够加快恢复脑震荡？目前随机对照研究的结果并不能回答上述问题，现有的脑震荡治疗指南建议也只是根据观察性实验研究结果制定的。近日，为研究儿童脑震荡后认知活动水平，B 查看更多
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2021-09-03
MixPlus旋涡振荡器主要适用于医学、生物工程、化学、医药等研究领域，是生物实验室对各种试剂、溶液、化学物质进行固定、振荡、混匀处理的必备常规仪器... 查看更多
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2021-09-09
医流商城提供Labnet VX200 微型漩涡混合仪转数0-2850转/分报价、参数、图片、特点、咨询等有效信息,全网最低价,100%正品保证,是您网上购买Labnet VX200 微型漩涡混合仪转数0-2850转/分的首选平台。 查看更多
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2021-09-14
For amplification of cognate sequences from different organisms, or for "evolutionary PCR", one may increase the chances of getting product by designing 查看更多
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2021-08-30
多管漩涡混合仪采用直流无刷电机和微电脑控制技术。独特的旋钮操作模式简单易用，通过更换不同的试管固定海绵，能够对各类常用试管进行混匀培养，最多一次可混合处理50个样品。适用于生物工艺学，微生物学和医学分 查看更多
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常见问题
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【求助】请问引物稀释时能用漩涡振荡器震荡吗?_问答详情_蚂蚁淘,...123
jiuselianhua2021-08-02
各位网友，大家好！
前几天我在稀释引物时，被老师看到我正在用漩涡振荡器震荡稀释过的100uM的引物，老师说不能强烈震荡，容易把DNA振断，那请问大家该用什么方法充分混匀？
另有一个问题：2OD的引物，是（1）全部稀释成5uM后4度保存还是（2）稀释成100uM先保存，等到用的时候再稀释成5uM？哪个更好？谢谢大家
前几天我在稀释引物时，被老师看到我正在用漩涡振荡器震荡稀释过的100uM的引物，老师说不能强烈震荡，容易把DNA振断，那请问大家该用什么方法充分混匀？
另有一个问题：2OD的引物，是（1）全部稀释成5uM后4度保存还是（2）稀释成100uM先保存，等到用的时候再稀释成5uM？哪个更好？谢谢大家
漩涡振荡器与旋转混匀仪有什么区别机械知道问答买卖机械网123
K莫尛1532017-10-21
摇床培养的作用： 1.传质，就是底物或代谢产物更好在体系内转移和发挥作用。
2.溶氧，在好氧培养过程中，空气是滤过开放的，所以通过摇到可以让更多空气中氧气溶解于发酵液中。
厌氧则不是这个作用了。
3.体系均一，有便于对不同参数的取样测定。
2.溶氧，在好氧培养过程中，空气是滤过开放的，所以通过摇到可以让更多空气中氧气溶解于发酵液中。
厌氧则不是这个作用了。
3.体系均一，有便于对不同参数的取样测定。
【求助】大家帮我看看我的SDSPAGE图吧 经验共享 分析测试百科...123
wenyangan2021-07-25
每孔加样量是：32ul蛋白＋8ul上样buffer（5乘）
1－5号蛋白浓度分别是（ug/ul）：0.71.12.11.64.8
1－3号为一种细胞，4和5号为LO2细胞
1－4号采用同一种方法提取蛋白，5号采用的是另一种方法
问题：4号比5号的蛋白浓度高很多，但是条带还没没5号的明显？？
4号和5号为什么会有拖尾尤其是4号，而1－3号则是条带太少（只有3条）
1－5号蛋白浓度分别是（ug/ul）：0.71.12.11.64.8
1－3号为一种细胞，4和5号为LO2细胞
1－4号采用同一种方法提取蛋白，5号采用的是另一种方法
问题：4号比5号的蛋白浓度高很多，但是条带还没没5号的明显？？
4号和5号为什么会有拖尾尤其是4号，而1－3号则是条带太少（只有3条）
vortex涡旋振荡器vortex涡旋振荡器批发、促销价格、产地货源 ...123
crhbnmri2017-10-21
漩涡混合器 漩涡混合器是一种将振荡和涡旋巧妙结合的还具备 Vortex 振荡混匀各种试管的功能,大大方便了2007-08-11 涡旋混合器和涡旋振荡器有什么区别? 3。
【求购】帮忙推荐震荡仪 实验室建设与采购讨论版论坛123
冰蝶2021-07-22
由于药物难溶，要购买震荡仪，请各位帮忙推荐
有多少种不同类型的震荡仪，型号是什么？
谢谢！
有多少种不同类型的震荡仪，型号是什么？
谢谢！
质粒dna的提取实验报告思考题123
shewoqishui2021-07-31
谢谢!
【求助】1%tritonx100的细胞裂解液能不能释放出细胞核内的蛋白? ...123
耳语的缠绵佟2017-10-21
本品是一种传统的细胞组织快速裂解液。使用本品裂解得到的蛋白样品可以用于常规的
Western、IP 等。主要成分为50mM Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40， 0.1% SDS。
使用本品裂解得到的蛋白样品，可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有
较高浓度的去垢剂，不能用Bradford 法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。
保存条件：4℃
制备细胞裂解产物：
1、800g 4℃离心5 分钟，收集细胞，估计细胞离心后的体积(PCV,106 cells ≈ 20ul PCV,
107 cells ≈ 100 ul PCV)
2、每50~100ul PCV 加入5 倍体积的蛋白裂解液（250~500ul）,冰浴中放置10 分钟，且每隔5
分钟在漩涡混合仪震荡30 秒；
3、12000g 4℃离心10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物；
4、假如所得蛋白产物较为粘稠，可95℃加热5 分钟，然后迅速冰浴5 分钟，12000g 4℃离心
10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物。
制备组织裂解产物：
1、取50-100mg 组织在冰上剪成碎片，用预冷的PBS 洗涤2 次，离心弃去PBS；
2、加入0.5-1ml 预冷的蛋白裂解液；
3、4℃用玻璃匀浆器匀浆20-40 次，直到95%的细胞被破碎，然后在冰浴中放置10 分钟，且每
隔5 分钟在漩涡混合仪震荡30 秒；
4、12000g 4℃离心10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得组织总蛋白产物；
5、假如所得蛋白产物较为粘稠，可95℃加热5 分钟，然后迅速冰浴5 分钟，12000g 4℃离心
10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得组织总蛋白产物。
6、20%的甘油保存于-70℃或-20℃。
Western、IP 等。主要成分为50mM Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40， 0.1% SDS。
使用本品裂解得到的蛋白样品，可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有
较高浓度的去垢剂，不能用Bradford 法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。
保存条件：4℃
制备细胞裂解产物：
1、800g 4℃离心5 分钟，收集细胞，估计细胞离心后的体积(PCV,106 cells ≈ 20ul PCV,
107 cells ≈ 100 ul PCV)
2、每50~100ul PCV 加入5 倍体积的蛋白裂解液（250~500ul）,冰浴中放置10 分钟，且每隔5
分钟在漩涡混合仪震荡30 秒；
3、12000g 4℃离心10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物；
4、假如所得蛋白产物较为粘稠，可95℃加热5 分钟，然后迅速冰浴5 分钟，12000g 4℃离心
10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得细胞总蛋白产物。
制备组织裂解产物：
1、取50-100mg 组织在冰上剪成碎片，用预冷的PBS 洗涤2 次，离心弃去PBS；
2、加入0.5-1ml 预冷的蛋白裂解液；
3、4℃用玻璃匀浆器匀浆20-40 次，直到95%的细胞被破碎，然后在冰浴中放置10 分钟，且每
隔5 分钟在漩涡混合仪震荡30 秒；
4、12000g 4℃离心10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得组织总蛋白产物；
5、假如所得蛋白产物较为粘稠，可95℃加热5 分钟，然后迅速冰浴5 分钟，12000g 4℃离心
10 分钟，将上清转移到新的离心管中，即得组织总蛋白产物。
6、20%的甘油保存于-70℃或-20℃。
ZS系列漩涡振荡筛使用说明书123
3453468152017-10-20
直线振荡筛功用及特色 直线振荡筛由筛框、筛网、绷簧、振荡电机、振荡电机台座、支架等组成，直线筛各有些功用剖析如下： 1、筛箱：由各种厚度不一样的钢板焊制而成，具有必定的强度和刚度，是直线筛机的首要组成有些。
2、筛框：由松木或变形量。
2、筛框：由松木或变形量。
漩涡振荡器和普通的振荡器一样吗? 生物材料 学术...123
骸魇NFY2017-10-21
没有漩涡振荡器可以踣啵蕃簸钹饽擘仢
ZS650漩涡振荡筛,放了好久,今天一用突然震动特别...科易网频道123
2017-10-31
把四个方向上下连在一起的扣子松了就好。最后问一下你漩涡式的用途
涡旋混合器与振荡器一样吗？123
我素CK3702017-10-21
摇床培养的作用： 1.传质，就是底物或代谢产物更好在体系内转移和发挥作用。
2.溶氧，在好氧培养过程中，空气是滤过开放的，所以通过摇到可以让更多空气中氧气溶解于发酵液中。
厌氧则不是这个作用了。
3.体系均一，有便于对不同参数的取样测定。
2.溶氧，在好氧培养过程中，空气是滤过开放的，所以通过摇到可以让更多空气中氧气溶解于发酵液中。
厌氧则不是这个作用了。
3.体系均一，有便于对不同参数的取样测定。
88880018 赛默飞世尔Thermo LP涡旋振荡器123
ballance1﹟d弼2017-11-04
（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术编辑本段 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在pH3.5～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。1、改良过碘酸钠法 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。
[标记步骤]
（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液0.1mL，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h。
（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。
（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2）6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉（SPA不需要进行此步）。
（7）将沉淀物溶于PBS（0.02M pH7.4）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不需加甘油），低温保存备用。2、戊二醛交联法 戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度范围，pH6.0～8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤]
（1）取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反应结合18h。
（2）用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。
（3）将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。
（4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h。
（5）加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
（6）装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。（二）过氧化物酶编辑本段简介 抗过氧化物复合物制备技术
Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。标记步骤 （1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。
（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温（20℃±）静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。
（3）加冷生理盐水反复洗涤-离心（16 000r/min，4℃离心20min）3次，弃上清，取沉淀物。
（4）加入过量HRP溶液4mL（2mg/mL）混匀后，移至小烧杯内。
（5）在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。
（6）立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。
（7）加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸铵的等量混合液后混匀。
（8）电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。
（9）以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。
（10）加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液（13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵）4℃透析3d，每天换液2次。
（11）17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。
（12）加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。（三）McAb-PAP制备技术编辑本段 用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP复合物。以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。（四）碱性磷酸酶标抗体制备技术编辑本段简介 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶名疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。标记步骤 （1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。
（2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。
（3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。
（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。
（5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。
（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。（五）碱性磷酸酶编辑本段 -抗碱性磷酸酶复合物制备技术
Mason等（1978），用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）桥联酶标技术。但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。采用改良的ELISA方法检测APAAP复合中AP的最适含量。具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD）。在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大；当AP增加到一定量时（约6～8mg/mL）、OD值保持稳定。展开
HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在pH3.5～12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。1、改良过碘酸钠法 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。
[标记步骤]
（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液0.1mL，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h。
（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。
（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2）6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉（SPA不需要进行此步）。
（7）将沉淀物溶于PBS（0.02M pH7.4）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不需加甘油），低温保存备用。2、戊二醛交联法 戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度范围，pH6.0～8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤]
（1）取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反应结合18h。
（2）用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。
（3）将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。
（4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h。
（5）加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
（6）装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。（二）过氧化物酶编辑本段简介 抗过氧化物复合物制备技术
Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。标记步骤 （1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。
（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温（20℃±）静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。
（3）加冷生理盐水反复洗涤-离心（16 000r/min，4℃离心20min）3次，弃上清，取沉淀物。
（4）加入过量HRP溶液4mL（2mg/mL）混匀后，移至小烧杯内。
（5）在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。
（6）立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。
（7）加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸铵的等量混合液后混匀。
（8）电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。
（9）以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。
（10）加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液（13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵）4℃透析3d，每天换液2次。
（11）17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。
（12）加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。（三）McAb-PAP制备技术编辑本段 用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP复合物。以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。（四）碱性磷酸酶标抗体制备技术编辑本段简介 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶名疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。标记步骤 （1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。
（2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。
（3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。
（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。
（5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。
（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。（五）碱性磷酸酶编辑本段 -抗碱性磷酸酶复合物制备技术
Mason等（1978），用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）桥联酶标技术。但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。采用改良的ELISA方法检测APAAP复合中AP的最适含量。具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD）。在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大；当AP增加到一定量时（约6～8mg/mL）、OD值保持稳定。展开
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