PurifiedhumanLDL(d=1.019-1.063g/mL)isoxidizedwithcopper(II)sulfateandlabeledwithDiI(1,1"-dioctadecyl-3,3,3",3"-tetramethylindocarbocyanineperchlorate).Thepurifiedprobeisultrafilteredthroughamembraneandpackagedasepticallyundernitrogen.Theproductisprovidedinasolutionwith154mMNaCland0.34mMEDTA,atpH7.2.
各位业内前辈，我们正在考虑引进符合GMP认证标准的CHO细胞系，用于表达可做疫苗生产的重组蛋白类。目前已有符合标准信息的是Thermofisher的CHO-S悬浮培养细胞资料，希望能再多了解一些和这株细胞类似的其他公司符合GMP标准的生产株细胞做个比较。谢谢指教！ 最近留意了几个消息，发现生产线一家比一家大，结合最近国家在搞药品上市许可持有人制度试点，五年以后这行业竞争会有多激烈，产能会不会过剩的。 百迈博生产线6000升（3000*2） 东耀生产线10000升（2000*5） 三生制药生产线30000升（5000*6） 信达生物生产线>15000升 百泰生物生产线4000升 药明康德生产线2000升（不知现在规模有没有扩大） 还有很多低调的公司可能规模更大…… 将来在国内，按照现有的产量结合所有生产线的总和生产出来的重组蛋白会不会以白菜价进入市场的， 大家好，想请教大家一个关于HPLC方法学的问题。 目前我们做的一个蛋白药，没有标准品，液相建立一个方法只想用于纯度鉴定，不去定量，这个方法所得到的图谱就一个主蛋白峰，面积归一化法相当于100%，现在就这个方法的方法学验证提出下面几点疑问： 1.因为我只做纯度鉴定，这个方法的方法学应该做系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这些，还是按照定量的全套加上定量限、线性、范围、准确度这些？ 2.纯度鉴定中，我觉得应该对杂质进行定量，但是我们的这个方法只有一个主蛋白峰，几乎没有杂质峰，这样的话这个方法学我应该以什么为标准证明纯度呢？需将样品进行适当的氧化、酸、碱破坏吗？然后证明破坏后主峰能和产生的杂质分开？ 3.对应生物蛋白药的杂质，应该属于无法获得的，如果通过强破坏，这个杂质也是不好鉴定的，是不是我只需要知道主峰能和强破坏的降解物分开，就可以说方法建立成功？还是生物药没有必要做这个强破坏，简单的走一下系统适用性、专属性、检测限、耐用性和精密度这样的流程就行？ 说的有点乱，主要是自己对这个生物药的HPLC纯度鉴定的方法学，实在是疑惑重重，希望有经验的大侠能帮忙解答下。非常感谢！
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国内或者国外进口皆可！？看来你不缺钱啊！
这个问题问的过于笼统！
首先，蛋白表达与纯化包括很多种类型，比如原核蛋白表达，哺乳动物蛋白表达，酵母蛋白表达以及昆虫蛋白表达等等，而现在生物实验中常说的蛋白表达纯化通常是指利用大肠杆菌表达系统的原核蛋白表达，这种表达方式比较简单，普遍都可以做。但是如果是指很多种蛋白表达系统的话，可以做的单位就比较少了。
另外，蛋白的表达成功与否还需要取决于蛋白的性质，所以前期一定要问清楚！
人类医学发展到今天,对某些疑难疾病还是不能彻底根治,如遗传疾病，器官坏死，和糖尿病等。这些疾病仅靠药物治疗只能减缓症状，而器官移植又受捐赠器官有限和免疫排斥等因素的限制而不能推广。干细胞是唯一有可能攻克这些疾病的治疗手段。但长期以来，获取多能干细胞(pluripotentstemcell)的主要来源为人的胚胎。这引起道德和宗教的争议，进而在美国等国家受到法律限制。另外，用异己的胚胎干细胞发展的治疗手段将来还是会遇到免疫排斥的问题。
2006年，日本科学家ShinyaYamanaka领导的实验室第一次证明，通过以反转录病毒为载体转基因表达四个转录因子，可以将小鼠或人的体细胞转变为与胚胎干细胞拥有相似分化和繁殖能力的细胞，命名为诱导性干细胞（iPS）。这一成果具有划时代的意义：1）干细胞的产生可以不再需要破坏胚胎，避免了道德，宗教和法律上的限制；2）不同疾病的诱导性干细胞可衍生出不同类型的疾病模型，为基础研究和药物筛选提供了强大的武器；3）理论上，各种疑难疾病可以通过病人自己的体细胞转变为干细胞，再分化为各种类型的细胞，组织，甚至器官，经过或不经过体外加工后，放回病人体内，治愈疾病。
在本论文中，研究人员成功地用四个转录因子的蛋白完成了由体细胞到诱导性干细胞的转变过程。自始至终，细胞的遗传信息没有受到任何影响。蛋白诱导性干细胞的重大意义包括：1）安全性：转化过程没有使用病毒，没有使用基因，没有任何改变细胞遗传信息的风险；2）普及性：蛋白诱导方法远比基因诱导方法简单易行。这样一来，iPS技术不再被几个资深实验室所垄断。大部分实验室都可以重复蛋白方法而获得iPS。也就是说，蛋白诱导方法大大降低了iPS领域的"门坎"。3）可行性：由于该方法的简单易行，重复性强，它可以被扩大化，产业化，进而被商业化。蛋白诱导干细胞方法将大大降低利用干细胞对病人"量身定做"的治疗手段的成本，使得这一商业模式成为可能。
如果说，ShinyaYamanaka博士的成果第一次使人类看到了一个梦想，那么这篇论文的发表标志着我们从梦想向现实跨出了关键的一大步。
CellStemCell,23April2009doi:10.1016/j.stem.2009.04.005
GenerationofInducedPluripotentStemCellsUsingRecombinantProteins
HongyanZhou1,ShiliWu4,7,JinYoungJoo5,7,SaiyongZhu1,DongWookHan5,TongxiangLin1,SuniaTrauger2,3,GeofferyBien4,SusanYao4,YongZhu4,GarySiuzdak2,3,HansR.Sch?ler5,LingxunDuan6andShengDing1,,
1DepartmentofChemistry,TheScrippsResearchInstitute,10550NorthTorreyPinesRoad,LaJolla,CA92037,USA
2DepartmentofMolecularBIOLOGy,TheScrippsResearchInstitute,10550NorthTorreyPinesRoad,LaJolla,CA92037,USA
3CenterforMassSpectrometry,TheScrippsResearchInstitute,10550NorthTorreyPinesRoad,LaJolla,CA92037,USA
4ProteomTech,Inc.,3505CADIllacAvenue,SuiteF7,CostaMesa,CA92626,USA
5DepartmentofCellandDevelopmentalBiology,MaxPlanckInstituteforMolecularBiomedicine,R?ntgenstrasse20,Münster48149,Germany
6LD***aInc.,SandownWay,SanDiego,CA92130,USA
7Theseauthorscontributedequallytothiswork
Groundbreakingworkdemonstratedthatectopicexpressionoffourtranscriptionfactors,Oct4,Klf4,Sox2,andc-Myc,couldreprogrammurinesomaticcellstoinducedpluripotentstemcells(iPSCs)(TakahashiandYamanaka,2006),andhumaniPSCsweresubsequentlygeneratedusingsimilargeneticmanipulation(Takahashietal.,2007,Yuetal.,2007).Toaddressthesafetyissuesarosefromharboringintegratedexogenoussequencesinthetargetcellgenome,anumberofmodifiedgeneticmethodshavebeendevelopedandproducediPSCswithpotentiallyreducedrisks(fordiscussion,seeYamanaka,2009,andreferencestherein).However,allofthemethodsdevelopedtodatestillinvolvetheuseofgeneticmaterialsandthusthepotentialforunexpectedgeneticmodificationsbytheexogenoussequencesinthetargetcells.Herewereportgenerationofprotein-inducedpluripotentstemcells(piPSCs)frommurineembryonicfibroblastsusingrecombinantcell-penetratingreprogrammingproteins.WedemonstratedthatsuchpiPSCscanlong-termself-renewandarepluripotentinvitroandinvivo.
▷ 重组蛋白生产平台
▪ HEK293细胞瞬转
▪ CHO细胞
▪ 昆虫细胞/杆状病毒
▪ 酵母细胞
▪ 大肠杆菌发酵
1. 金开瑞的与传统的蛋白表达系统相比，省略了耗时耗力的质粒转化、细胞培养、收集、破碎和离心等, 极大地提高了工作效率；
2. 反应体系小，能同时平行合成多种不同的蛋白质；
3. 反应周期短，能满足高通量配体筛选和蛋白质组学的科研要求；
4. 开放的反应体系，便于改变各项反应条件，有利于调控基因的转录，蛋白质的合成和翻译后修饰，避免包涵体的形成；
5. 稳定的反应体系，可以偶联其它工艺，形成自动化、程序化、规模化生产，加快重组蛋白的纯化、功能表征和后续的结构解析；
6. 无细胞结构限制，可用于生产对宿主有毒害作用的外源蛋白，避免蛋白表达对宿主细胞的致死作用；
7. 添加非天然氨基酸或同位素标记氨基酸，表达特殊蛋白。
8.对于多次跨膜或由于疏水性强导致的普通细胞系表达困难的项目有显著改善。
2.准备旋转培养瓶，用于按比例扩增Sf9细胞，将合适大小的两孔盖连接在转瓶的一个 侧臂，另用一平盖接在另一侧臂。将一段短管（约6英寸或15 cm）装在通气孔中，末端连接一滤器，借助张力器用管索将管子与通气孔和滤器固牢。
3.将一段长管（30~60 cm）连接至进气孔，并在末端连接一滤器，用管索加固，另一段管子连接于滤器的另一端，用管索固牢。管子末端用铝箔封好。
4.将与两孔装置相对的侧壁上的盖子旋转90度以松开，高压灭菌培养瓶1 h。
5.将适应了无血清培养液的细胞接种于经高压灭菌的培养瓶中。将培养瓶装至半
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