MolecularWeight: | 524.23 |
Formula: | C20H16Br2N2O3S |
Purity: | ≥98% |
CAS#: | 312756-74-4 |
Solubility: | DMSOupto100mM |
ChemicalName: | 3-(N-benzylsulfamoyl)-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide |
Storage: | Powder:4oC1year.DMSO:4oC3month;-20oC1year. |
BIOLOGicalActivity:RS-1waspreviouslycharacterizedasaRAD51-StimulatorycompoundandnowfoundtobeanHDRenhancertoenhanceCRISPR/Cas9-andTALEN-mediatedknock-inefficiency.Itincreasestheknock-inefficiencybytwo-tofive-foldatdifferentloci,whereasNHEJinhibitorSCR7hasminimaleffects.RS-1wasappliedforanimalproductionandhaveachievedmultifoldimprovementontheknock-inratesaswell.RS-1canstimulatethehumanhomologousrecombinationproteinRAD51invariousconditions.InPC3prostatecancercells,RS-1–inducedlethalitywasaccompaniedbytheformationofmicroscopicallyvisIBLeRAD51nuclearproteinfocioccurringintheabsenceofanyDNA-damagingtreatment.TreatmentwithRS-1promotedsignificantantitumorresponsesinamousemodel.HowtoUse:Invitro:RS-1wasusedat15µMfinalconcentrationinTALEN-orCas9-mediatedknock-inexperiments.Invivo:RS-1wasusedat7.5 μMfortheinvivoknock-inanimalproduction.RS-1canbedosedtoanimalbyIPinjectionat110mg/Kgonceperdaytogetantitumorresponses.Reference:
- 1.JayathilakaK,etal.AchemicalcompoundthatstimulatesthehumanhomologousrecombinationproteinRAD51.(2008)ProcNatlAcadSciUSA.105(41):15848-53.
- 2.MasonJM,etal.TheRAD51-stimulatorycompoundRS-1canexploittheRAD51overexpressionthatexistsincancercellsandtumors.(2014)CancerRes.74(13):3546-55.
- 3.SongJ,etal.RS-1enhancesCRISPR/Cas9-andTALEN-mediatedknock-inefficiency.(2016)NatCommun.7:10548.
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近几年来,基因重组的技术层出不穷,包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。
关于这些技术的具体原理和操作细节,这里不做展开介绍,主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中,如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。
一.混合克隆pool验证
质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool1000个细胞以上离心,去上清,PBS洗一遍,细胞沉淀溶于适量的PBS中,煮5min后模板就制备好了,剩余的pool细胞做有限稀释,一般5块板足够。
分析敲除位点的上下游序列,设计合适的引物PCR扩增目的基因片段,与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟,酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测,由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞,则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要,很多杂志投稿时需要这张图,或者有计算突变率的要求。
二.阳性克隆筛选
上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆,待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时,取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列,设计合适的引物,并从提取的基因组中扩出目的片段,然后选择CruiserTM或者T7EI进行酶切分析,最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。
为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化:
1、尽可能提高单细胞的存活率
a)对于单个细胞很难存活的细胞,如果是贴壁细胞,可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂;而对于悬浮细胞,则推荐采用CellPlaza(共培养的原理),都可以极大的提高细胞的存活率;
b)对于很容易老化的细胞,推荐对细胞进行永生化改造,永生化的方法有很多,这里不做具体推荐。
2、采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒
这样的试剂盒,市面上也比较多,但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒,建议选择Qiagen或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌,Genloci这家公司是主要做基因重组的,所以,他们开发的一些产品针对性比较强,而且价格便宜,建议优先使用。
3、设计合理的引物和选用高保真的Taq酶
引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处,或者上游200bp和下游100bp处,这样的好处是后面进行酶切分析的时候,对于阳性的克隆,可以很容易观察到2条分开的条带。
Taq酶,建议是用NEB的Fusion或者Q5,毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失,所以,高保证是必要的,防止产生假阳性的结果。
4、选择高特异性的错配酶
目前用的比较多的是CELI和T7EI两种酶,CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶,活性高,不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品,价格较贵,货期较长;CruiserTM价格合适,同时货期短,国内可以2-3天内到货,做到真正质优价廉。
T7EI是NEB的产品,最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外,还可以识别十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA,正是因为这个特点,很容易导致假阳性的现象。
测序公司往往是比较容易忽略的一个环节,很多人送测序后,拿到的测序结果经常发现没信号,就认为是自己的样品有问题,而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式,测序是苦力活,人员流动比较大,所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好,实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以,一定要找一些资质比较好的测序公司,同时,发现问题的时,可以考虑换一家公司再测一遍。
缺点:质粒仍然较大,转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性,局限了基因编辑的运用范围,而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
基因敲除指利用染色体间基因打靶的原理,通过将设计好的打靶载体导入细胞后,同源臂发生同源重组,从而在基因组的某个特定位点引入预定的突变,获得基因型发生了改变的动物。可以分为基因敲入和基因敲出:基因敲入即引入新的基因或突变;基因敲出即使某个特定的基因得到破坏,可以用于研究基因的功能。
科研人员所使用的“基因编辑技术”,顾名思义,能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来,就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势,技术不断改进后,更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术
这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前,有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称,曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。
那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术,为何能够获得如此这般青睐,又何以在短短两三年时间内,发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一,并有近700篇相关论文发表?它将来又会如何影响到我们的生活?
CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比,其成本低、制作简便、快捷高效的优点,让它迅速风靡于世界各地的实验室,成为科研、医疗等领域的有效工具。
大家好,我是CRISPR新手。在设计一个白蛋白基因相关的sgRNA,但是白蛋白的序列有17多kb,很多设计工具都无法导入。请问大家我这个问题该怎么解决呀??
http://www.addgene.org/crispr/guide/
科学家发现,细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后,可以获得其部分DNA(脱氧核糖核酸)片段并整合进基因组形成记忆,当再次遭到入侵时,转录出相应的RNA(核糖核酸),利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR/Cas9技术就是利用这一原理,用一种定制的RNA引导Cas,对预设DNA位点进行切割,造成DNA断裂,启动细胞内基因组修复机制,实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
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