细胞表面标记的检测技术一活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
| 实验方法原理 | 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 抗体血清 试剂、试剂盒 | RPMI1640DPBS洗涤液固定液 仪器、耗材 | 玻璃管塑料管离心机显微镜 实验步骤 | 1. 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法） 2. 用10％FCSRPMI1640调整细胞浓度为5×106～1×107/ml 3. 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4℃30min 4. 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右，1000rpm×5min 5. 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇，4℃30min 6. 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右，1000rpm×5min 7. 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液） 8. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7天） 注意事项 | 其他 | 一、附录 1. DPBS（×10，贮存液） NaCl80g，KCl2g，蒸馏水加至1000ml，Na2HPO411.5g，临用时用蒸馏水1∶10稀释，KH2PO4 2g 2. 洗涤液 DPBS900ml，FCS50ml（终浓度5％），4％NaN350ml（终浓度0.2％） 3. 固定液 DPBS1000ml，葡萄糖20g（终浓度2％），甲醛10ml，NaN30.2g（终浓度0.02％） |
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发布于 ： 2018-08-07
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