╰★☆★╮【专题讨论】单克隆抗体技术：从理论到应用讨论专帖╰★☆★╮[精华]
2021-07-20
问题描述：
★☆★★☆★★☆单克隆抗体技术相关总结与讨论专帖★☆★★☆★★☆
一、前言
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
一、前言
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
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20021108
用户
四、关于饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。1．材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。2．操作方法（1）拉颈处死小鼠。（2）70％酒精浸泡消毒10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。（4）用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（5）1 000r／min离心10min。（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。个人认为取饲养细胞时切忌贪心，别总是想多取一些，因为这样有可能造成一些不必要的麻烦，我又一次取饲养细胞时就曾经将不知是什么血管刺破，导致所取的饲养细胞里面出现大量的红细胞。有人说饲养细胞可以不用，我觉得还是用一点比较好，但是一定不要太多，占到30%就足够了，太多了很影响细胞的观察，而且会导致骨髓瘤等细胞不能很好的贴壁。论坛资源：求助：关于单抗制备中的饲养层细胞(讨论)制备单抗过程中小鼠的饲养条件请问BALB/c小鼠冲洗腹部得到的巨噬细胞数量大约为多少？ 【公告】难得的加分好机会！诚邀您携手缔造细胞图片新精彩！
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20021108
用户五、取脾脏融合用的免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。取脾脏也是一个比较重要的环节，可以说如果出现污染有很大一部分原因是由于融合过程引起的，还有一部分原因就是由于取脾脏这个环节引起的。取脾脏的要点就是一定要尽量无菌操作，根据实际情况来看，完全无菌是不可能的，但是取脾脏的时候一定要尽量减少操作的时间，主要是研磨这一环节。在研磨之前取脾脏之后，首先要将脾脏上面包被的膜剪掉，这样会节省很多研磨的时间。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。论坛资源：【求助】如何提取脾淋巴细胞悬液？（求教）脾细胞培养【求助】脾细胞形态脾细胞如何保存[求助]脾细胞贴壁吗（求助）小鼠脾细胞分离的操作说明【求助】关于小鼠脾细胞的几个问题【求助】脾细胞能否冻存后用于SP2/0融合
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20021108
用户六、融合与筛选最重要的一步是融合，我想这也是单抗制备过程中最难的一步了。 (一) 细胞融合流程 1 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。 2 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 3 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。 4 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。 5 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。 6 在室温下融合: ①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。 ② 作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 ③ 加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。 7 离心，800rpm，6分钟。 8 弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。 9 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。 10将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。 一般一块96孔板含有1×107脾细胞。 (二) HAT选择杂交瘤 应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。 一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。 因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。 50×HAT H: 5×10-3M A: 2×10-5M T: 8×10-4M 一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。融合的关键除了无菌操作之外就是动作一定要轻柔，就像制备感受态细胞一样，而且一定要混匀，不然在镜下会出现成团的细胞，这是很影响本就不高的融合率的。论坛资源：关与单抗融合率的问题单抗细胞融合为何不成功！！(求救)单抗制备过程中融合的问题【请教】作单抗细胞融合时间的选择求助：单抗融合后细胞不分裂【求助】作单抗为什么细胞融合后会边分裂边死亡【求助】做单抗的细胞融合时不加饲养细胞会有什么样的影响[求助]请问做单抗融合前的血清效价需要多少啊?不甚感激！做单抗融合时应该注意哪些问题呢？（求助）融合后需要换液吗请教单抗！！！！！！！！！！！【专题讨论】杂交瘤细胞融合已经天拉未见融合细胞生长请教单克隆抗体的问题【请教】未被免疫过的小鼠脾细胞能与sp2/0细胞融合吗？【求助】谁做过细胞融合？请赐教[请教]讨论一个单抗的问题关于融合的问题？【求助】单抗制备过程奇怪现象？【求助】请问。在细胞融合过程中应该注意什么问题啊【请教】关于单抗制备的几个问题（求助）细胞融合第十四天抗体检测整个96孔板都显色【求助】用HAT选择培养液中止PEG作用，可以吗？（求助）融合的杂交瘤细胞一般要经过几次筛选（求助）关于杂交瘤的筛选（请教）杂交瘤问题请教高手：细胞融合后的筛选(请教)有关ELISA筛选单抗的筛选标准问题
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20021108
用户七、抗体的鉴定 筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。 常用的方法有: 1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。 2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。 4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。论坛资源：【请教】间接ELISA检测单抗时，阴性对照最好用什么？（求助）关于单抗ELISA检测值的不稳定
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20021108
用户八、性质检测对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定: 1. 抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。② 制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。 2. McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉淀线的形成。 3. McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。 4. McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。 5. McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。论坛资源：求助：单克隆抗体亚型鉴定试剂单克隆抗体制备中的鉴定用试剂~~急！！！（请教）单克隆抗体鉴定时必须鉴定IGg亚类吗？有什么意义呢？急！！关于单克隆抗体的问题
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20021108
用户九、后续工作克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 (一) 克隆化方案 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。 1. 有限稀释法的程序 ① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备) ② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml ③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。 ④ 培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。 ⑤ 第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。 注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。 2. 软琼脂法 ① 软琼脂的配制 含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640 1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。 0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。 ② 用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。 ③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。 ④ 1ml0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。 ⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。 ⑥ 4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。 ⑦ 检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。 (二) 杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。 杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一管。 细胞冻存液: 50％小牛血清 40％不完全培养液 10％ DMSO(二甲亚砜) 冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。论坛资源：（请教）杂交瘤的有效期限【求助】有关杂交瘤细胞的克隆问题
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20021108
用户十、tips由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。 其主要失败原因和影响因素有: 1. 污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。 2. 融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。 3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 ① 融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。 ② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 ③ 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。 三要: 要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。 要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。 要定期进行再克隆。 三不要: 不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。 不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。 不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。 4. 杂交瘤细胞难以克隆化 可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。★☆★★☆★★☆相关总结暂时结束，以后会陆续补充。★☆★★☆★★☆★★★
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suijianxin
用户好东西，谢谢，劳动节勤苦了。
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xj967536
用户好样的,谢谢啊
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martin4720
用户总结的很好！！！！
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yaplewang
用户20021108兄又放卫星了。小弟五体投地，四腿朝天！顶！！一定回去好好研读。
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wgdtxj888
用户的确值得加4分，楼主辛苦！
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20021108
用户感谢以上版主及战友的鼓励，过奖了，呵呵。我建议将这个帖子变成一个关于单克隆抗体技术的讨论帖，广大战友有什么做单抗的新想法，以及在实际操作中遇到什么困难，大家可以提出来讨论一下，互相提高嘛！我先来一个，援引免疫版的一个帖子：问：【求助】作单抗为什么细胞融合后会边分裂边死亡在做细胞融合后的第3～4天看到有细胞分裂的现象，但分裂象不是很多，在第3天又补加了HAT培养液，仍不见旺盛的细胞分裂，第5～6天开始看到有4~5个细胞聚集在一起的现象，但再往后融合后的杂交瘤细胞就开始死亡，现在已经第10天了，杂交瘤细胞几乎都死了，但巨嗜细胞及正常的脾细胞（在第3天补液时加入了一些正常对照组老鼠的脾细胞）却还有生长，这是我做的第3次融合了，每次都出现这种情况，请大家帮忙分析一下原因。谢谢！急！20021108答：展开引用20021108wrote:在第3天又补加了HAT培养液我觉得这里可能有点问题，就是在第三天的时候基本上需要换液了，而不是补加，换液可以将大量死亡的骨髓瘤细胞除掉一部分，这样才有利于杂交瘤的生长，而且骨髓瘤破裂死亡会释放大量的毒素，这对于杂交瘤的生长也会产生极大的负面影响。还有一个方面就是刚开始的几天杂交瘤的生长对于血清的质量要求是非常高的，建议你在这个阶段使用进口的血清，过了十天左右可以换成国产血清配的HT培养液了。再有一个问题就是污染了，但是可能性不大。96孔板养细胞污染是不可避免的，但是要是所有的孔都这样的话，多数不是由污染造成的，因为怎么也不可能所有的孔都被污染了呀，如果是的话，你就只能加双抗了，或是提高无菌操作的水平，呵呵。......waynepionnet答：展开引用waynepionnetwrote:讨论一下，个人认为楼主的这种操作应该问题不大的，从我的经验来说，我更倾向于这种处理办法，实验也证明这种做法是可行的。原因有二：1、融合后的细胞比较脆弱，此时不宜在毫无预适应的情况下就换液，此种做法可能会导致融合细胞死亡或染色体丢失；2、骨髓瘤细胞的融合破碎死亡释放毒素并不是在融合后培养中才开始的，而是在加入PEG融合时就已经出现了，而且融合操作过程中的破碎死亡应该是细胞破碎死亡的主要阶段。而融合后一般还要用基础培养基洗涤。所以，细胞分泌的毒素应该不是主要的影响因素。对于血清影响的说法，我比较赞同，我就曾经遇到这样的情况，对于无单抗实验基础的实验室或刚购买用于单抗融合培养的血清，一定要进行浓度筛选培养预实验，确定支持单克隆生长。此外，除污染外，PEG的毒性，HAT的浓度可能也是你另外需要考虑的问题，PEG的本身是有毒性的，但在融合过程中这种毒性是可控的，主要是与浓度、分子量大小和融合时间，前两者按照实验指导书上来操作，可能都没有什么问题，可融合时间的控制却很难（尤其是新手），这需要实践来提高了。HAT中HT过低或A浓度过高对细胞也是有毒性的，可能也会出现楼主说的情况。还需要注意的问题，融合前细胞的活力、骨髓瘤细胞与小鼠的品系是否纯也是很重要的，这个可能是实验失败的潜在原因。......与很多因素有关这是肯定的，现在探讨一下主要原因。我昨天又与二导（九十年代就从事单抗研究的一位）探讨了一下这个问题，除与waynepionnet战友的共同观点外，他也认为三天后确实应该是换液，而不是补液。大家怎么看这个问题呢，这的确也是一个很常见的问题，但是当我们尝试了几次之后总会碰到不出现这种现象的时候，我们也就没有深究其原因了。现在讨论一下到底是什么原因。如果大家有什么其他问题也可以在这里提出来，讨论一下。
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FQ8Q280
用户goodwork!
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FQ8Q280
用户goodwork!
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bluesky9696
用户棒极了，顶！
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20021108
用户提一个常见的问题，感兴趣的讨论一下：到底影响融合（就是从骨髓瘤和脾细胞融合到第三天见到克隆为止）的成功率的因素到底有哪些呢？
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lovejeson
用户融合的温度以及PEG,还要吹打温和
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sanshuiji129
用户20021108从你的总结来看：加PEG的速率；稀释PEG的速率；融合的温度都有提到。它们应该属于影响因素。但是他们影响的程度可能不尽相同：我们实验室有人做融合时并没有在37度水浴，只是要PEG37度水浴。我们实验室她们做融合时尽量避免吹打，以免把黏附在一起的细胞吹打开来。另外，融合所用的试剂的浓度也是很重要的。你的工作很有意义，你是做单抗的吗？如果可能的话，能不能将这些材料精减一下，这样后面做单抗的人就有正确的指导，少走很多弯路了！
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20021108
用户lovejeson融合的温度以及PEG,还要吹打温和我个人认为这是一部分因素，而且是很主要的一部分因素，谢谢参与。虽然单克隆抗体制备技术很成熟，但是我第一次做的时候居然一个克隆都没有长，之后我考虑了很长时间到底是什么影响融合的成功率，所以现在想跟大家讨论讨论，请大家多提宝贵意见。
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20021108
用户展开引用sanshuiji12920021108从你的总结来看：加PEG的速率；稀释PEG的速率；融合的温度都有提到。它们应该属于影响因素。但是他们影响的程度可能不尽相同：我们实验室有人做融合时并没有在37度水浴，只是要PEG37度水浴。我们实验室她们做融合时尽量避免吹打，以免把黏附在一起的细胞吹打开来。另外，融合所用的试剂的浓度也是很重要的。你的工作很有意义，你是做单抗的吗？如果可能的话，能不能将这些材料精减一下，这样后面做单抗的人就有正确的指导，少走很多弯路了！......谢谢你的提醒，我试试。你在上面提到你们实验室做融合的时候不吹打，这和参考资料上说的不一样，我个人认为也不可取，不吹打那不是很多细胞都会混成一团，这样细胞的密度各孔之间会差别很大的，不是吗？我也认为温度影响不是很大，但是有个名校的同学跟我说他们实验室认为融合最重要的因素就是温度，矛盾吧。:?)但是我认为融合时候的骨髓瘤细胞的状态也能起到决定性的作用。提到PEG就不得不说一下，关于PEG的浓度，各个实验室，各个参考资料上都不尽相同，大家能不能说一下你们用的PEG的浓度。我们用的是50%的PEG，配方是10gPEG加入10mlPBS。
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wfy2004026
用户单抗制备中，遇到很多困难。花了一天的时间才看完楼主的东西。非常好。有几个问题请教：1.我用的PEG是按照司徒镇强主编的《细胞培养》上的方法来配制，用的是完全培养液加PEG。可是大多数人说用无血清培养基配制，请问对融合的影响大吗？2.采集脾细胞时我用的是0.91％NH4CL来裂解红细胞,作用五分钟，不知是否影响融合率。3.我收集的小鼠血清就是分装－20度冻存，没有加NaN3,有关系吗？
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20021108
用户展开引用wfy2004026单抗制备中，遇到很多困难。花了一天的时间才看完楼主的东西。非常好。有几个问题请教：1.我用的PEG是按照司徒镇强主编的《细胞培养》上的方法来配制，用的是完全培养液加PEG。可是大多数人说用无血清培养基配制，请问对融合的影响大吗？2.采集脾细胞时我用的是0.91％NH4CL来裂解红细胞,作用五分钟，不知是否影响融合率。3.我收集的小鼠血清就是分装－20度冻存，没有加NaN3,有关系吗？......请教我不敢当，咱们互相学习吧。:)1、既然大多数人都是用无血清的培养基来配的，为了保险起见你也就先用无血清的配吧，等真拿到克隆了再用完全培养基试验吧。因为我是用PBS配的做出来了，但是第一次也是用完全培养基作的，但是没见到一个克隆。当然这不能准确说明完全培养基不行，但是可能真的不如无血清的结果好。因为PEG对于细胞融合来说非常重要。2、0.91％NH4CL你是在参考资料上找到的吗？我用的红细胞裂解液是0.83%的氯化铵，你的这种配方我没试过，不知道对脾细胞有没有损伤。3、这个应该没有关系，因为我也是像你这么做的。
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lovejeson
用户我做的时候是把PEG37度先放置10分钟，然后再加入混合的细胞中，整个融合过程是在30度水浴中完成。PEG用的是SIGMA公司的，每次融合加入1ml,而且加入的时候是缓慢滴入的。
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20021108
用户lovejeson我做的时候是把PEG37度先放置10分钟，然后再加入混合的细胞中，整个融合过程是在30度水浴中完成。PEG用的是SIGMA公司的，每次融合加入1ml,而且加入的时候是缓慢滴入的。能否说一下你融合的细胞量？种了几块板子？细胞密度我想也是融合过程种很重要的。
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dawn_grace
用户做融合肯定要用不带血清的培养液配PEG了，你想一下，融合时脾细胞和骨髓瘤细胞用无血清培养液去洗的道理就知道了。无血清很重要。
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wfy2004026
用户呜！我的融合率本来就很低，现在克隆又死了。就是用的完全培养基配的PEG，难道就是这个原因吗？
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wfy2004026
用户还有，我看到别人都说免疫后的小鼠脾脏比正常大，可是我免疫的两只小鼠在融合时脾脏都没有看见明显的增大，但是血清效价都比较高，达1：16000以上。为什么？我采用的是脾内免疫法。
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20021108
用户wfy2004026呜！我的融合率本来就很低，现在克隆又死了。就是用的完全培养基配的PEG，难道就是这个原因吗？我觉得不全是这个原因。融合几天后的细胞会出现大量的死亡，而死亡的细胞会释放出大量的酶、毒素等物质，这些物质可能对于细胞的影响比较大。
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xkwei
用户各位单抗前辈：今年做融合做了5次一次都没融合上，愁死了，帮忙分析一下原因：1。SP2/0细胞在融合前出现很多大的细胞，用8N培养不死，但是对HAT耐受性也非常强，三天也不能把它完全杀死，换用其他批次的细胞，在培养过程中还是会产生。大细胞的产生没有影响其他细胞的生长。这与血清还是抗生素有关吗。（培养基是20%1640+1%双抗）2。我们这边PEG用的是4000，自己配的。（0。6g高压过的PEG4000+12滴1640）PH值在7-7。5左右。另外可能还有一些关键因素，请各位高手指点帮忙，我快不行了，来不及毕业了，郁闷崩溃中啊……异常感谢！
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xkwei
用户其实去年我也做了好几次融合，都融合上了，今年旧感觉SP2/0老有问题，换了批次还是不顶事，就是很多个头很大的细胞。其他细胞状态都还是不错的。所以不知道问题在哪。对了我现在的老鼠比较老，8个月了，但是效价还是能达到1-2万。老板说应该没有太大问题，哪怕有影响也不会一个都没有！
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20021108
用户展开引用xkwei各位单抗前辈：今年做融合做了5次一次都没融合上，愁死了，帮忙分析一下原因：1。SP2/0细胞在融合前出现很多大的细胞，用8N培养不死，但是对HAT耐受性也非常强，三天也不能把它完全杀死，换用其他批次的细胞，在培养过程中还是会产生。大细胞的产生没有影响其他细胞的生长。这与血清还是抗生素有关吗。（培养基是20%1640+1%双抗）2。我们这边PEG用的是4000，自己配的。（0。6g高压过的PEG4000+12滴1640）PH值在7-7。5左右。另外可能还有一些关键因素，请各位高手指点帮忙，我快不行了，来不及毕业了，郁闷崩溃中啊……异常感谢！......骨髓瘤细胞可能有点问题，如果是骨髓瘤细胞有问题的话，那融合率肯定是很低的，甚至是没有。你的融合不成功到底是融合率低还是跟本就没有杂交瘤生长呢。建议你再融合之前，先将骨髓瘤细胞打到小鼠腹腔里面，12天之后从小鼠腹腔里面取出来，这样能保证骨髓瘤细胞没有污染，又能保证骨髓瘤细胞的状态。PEG可能不是很大的问题，我们同学peg1500、3350等都用过，都没有什么问题，但是融合的时候里面添加的一些助细胞生长的东西还是要加的，是在着急就买个细胞因子算了，先保证了毕业再说。既然你曾经做出来过，你就比一下看看跟上次有什么不同，然后仔细考虑考虑原因。这个操作每个地方跟另一个地方是不一样的，最重要的还是自己摸索。祝你好运。
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