2013年6月8日做了两个月的WB,hif-1α还是没有做出来 ,按园子里的前辈方法做了还是没有,也不知道是不是抗体问题,先买了santacruz ,后又买了novus的,所以在这想请教下哪位老师...
原标题：实验技术|蛋白免疫印迹WB（下） 科研就像赛跑，你比别人跑的快，就比别人多发几篇SCI~ 前两期，给朋友们带来了 实验技术|蛋白免疫印迹WB（上） 实验技术|蛋白免疫印迹WB（中） 做了很久的WB，走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，才是实验成功的基石。 蛋白免疫印迹（WB）是基于抗原抗体的特异性结合作用，以检测复杂样品中的某种蛋白，并对其进行半定量分析的一种方法。 主要用于靶标蛋白特异性表达的定性或半定量分析，蛋白与蛋白或蛋白与DNA相互作用的后续分析，以及蛋白修饰的鉴定分析。 常见问题分析 1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？ 原因有很多： a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞； b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性； c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题； d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。 2.我做的蛋白质分子量很小（10 kDa），请问怎么做WB？ a)可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可； b)也可选择孔径0.22 μm的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系。 3.我的目的带很弱，如何加强？ a)可以加大抗原上样量，这是最主要的； b)也可以将一抗稀释比例降低； c)还可以延长曝光时间。 4.DAB好还是ECL好？ DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物； ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。 5.胶片是一片空白，是怎么回事？ 如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光； b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活； c) ECL底物没覆盖到相应位置； d) 一抗选择不当二抗失活； e) 二抗失活。 6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？ NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。 7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？ 一般5×10^6就足够。 8.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？ 可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5 mm的。 9.大分子量蛋白200 kDa，在做WB要注意什么？ a) 做200kDa蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择 7%的；剥胶时要小心； b) 转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。 c) 转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦! 10.免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？ 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。 11.WB中抗体的可以重复应用吗？ 抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4℃保存，避免反复冻融。 12.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？ 无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。 原因分析及解决办法 此次给大家带来的干货到此结束啦 ~掌握十个小节内容赶紧下载手册吧~ 实验技术WB 1.蛋白样品准备 2.蛋白定量 3.上样 4.凝胶电泳 5.转膜 6.封闭 7.孵育一抗 8.孵育二抗 9.显影 10.常见问题 后台回复【实验技术WB】 免费下载实验手册，精彩内容立刻掌握！ —END— ——华美生物·让科研变得有温度！——返回搜狐，查看更多 责任编辑：
经类固醇冲击校正后，西法木单抗组SLEDAI评分出现积极变化
来自美国巴尔的摩约翰斯·霍普金斯大学医学院的MichellePetri等人进行了一项研究，该研究的目的是评价中至重度的成人系统性红斑狼疮（SLE）患者多次静脉（IV）使用西法木单抗安全性和耐受性。研究结果在线发布在2013年4月的ARTHRITIS&RHEUMATISM（关节炎与风湿病）上。研究者发现，该项针对西法木单抗的观察性安全性/耐受性和临床活动的研究结果支持其可能进一步发展为SLE的治疗用药。
这是一项多中心，双盲，安慰剂对照，连续性剂量递增性研究，受试者按照3：1比例被随机分接受四个不同剂量西法木单抗治疗（0.3、1.0、3.0或10.0mg/kg）或者安慰剂治疗，西法木单抗和安慰剂均是每两周静脉使用一次，共使用26周，总共随访24周。安全性评估包括治疗相关的紧急相关不良事件（AEs）和严重AEs。药代动力学、免疫原性和药效性均是评价指标，疾病活动度也被记录下来。
研究结果如下，该研究共纳入161位受试者，121位接受西法木单抗治疗（其中26位的西法木单抗治疗剂量为0.3mg/kg，25位为1.0mg/kg，27位为3.0mg/kg，43位为10mg/kg），40位接受了安慰剂治疗。受试者以女性为主（95.7%）。在基线时，患者系统性红斑狼疮活动度为中至重度（平均SLE疾病活动指数[SLEDAI]积分为11.0），绝大多数（75.2%）患者高表达Ⅰ型干扰素基因型。西法木单抗组vs安慰剂组：≥1个治疗相关AE的发生率是92.6%vs95.0%，≥1个严重AE的发生率是22.3%vs27.5%，≥1次感染的发生率是67.8%vs62.5%；由于不良事件而停药的概率是9.1%vs7.5%，死亡发生率是3.3%（n=4）vs2.5%（n=1）。血清西法木单抗浓度以剂量依赖性线性递增。治疗过程中，基线高表Ⅰ型干扰素的患者的Ⅰ型干扰素表达的受到持续抑制。西法木单抗组和安慰剂组相比，在临床疾病活动度（SLEDA和英国狼疮评估小组得分）方面无统计学差异。但是，校正类固醇冲击后，SLEDAI从基线开始，随时间变化，出现积极趋势。与基线时相比，西法木单抗组患者的补体C3或者C4水平，在26周时趋于正常。
该项针对西法木单抗的观察性安全性/耐受性和临床活动的研究结果支持其可能进一步发展为SLE的治疗用药。
2020年3月23日b) 转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。 c) 转膜液中甲醇含量可适当降低,推荐使用湿装转膜效率更高哦! 10.免疫组化和WB可以用同一种抗体吗? 免疫组...
查看完整版本请点击这里：
【求助】关于hif-1
做了两个月的WB，hif-1α还是没有做出来 ，按园子里的前辈方法做了还是没有，也不知道是不是抗体问题，先买了ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ，后又买了ｎｏｖｕｓ的，所以在这想请教下哪位老师做出来过，并且现在仍有抗体的，能否转卖点给我，因为现在再从国外买几乎是不可能的了……查看完整版本请点击这里：
【求助】关于hif-1
我也来说两句
查看全部回复
131415 (2013-6-08 10:36:29)
现在怎么样？做出来了吗？
我做了几次，也都没出。
pou (2013-6-08 10:36:47)
有一次将抗体浓度增加到1：200 隐约看到很弱的条带 （之前用的浓度都是1：500）的 但是没有阳性对照 所以也不确定到底是不是 现在已经放弃了
pou (2013-6-08 10:37:13)
请牛人们帮助分析一下 这样条带问题存在哪里？上样？还是转膜不够好？
caihong (2013-6-08 10:37:50)
我在做novus的HIF-1α
我一般是30V过夜转膜16小时，再100V转1小时
一抗1：1000
二抗用的康城的1：5000
你的发光液和显影液都是新的吗？
zzzz (2013-6-08 10:39:54)
我用的是BD Bioscience的，稀释1:1000，一次就出来了。
BOSS2011 (2013-6-08 10:40:20)
相关疾病：
肿瘤
你确信你的蛋白有表达么？
很多情况下，细胞内的hif的mRNA可以很高，但是因为有氧存在下
hif的蛋白很快被降解，所以很多肿瘤细胞在体外培养的时候，WB是杂不出的
如果不是在厌氧培养箱里，一般的要加入适量的氯化钴培养一段时间，会杂出很强的条带的。
其实你也可以这样做个对照啊，用别人已用的细胞系和培养条件，得到细胞总蛋白，或者有纯化的hif蛋白，WB的时候用来做个对照，如果纯化的蛋白都杂不出来，那才是你体系的问题吧。
pou (2013-6-08 10:40:51)
多谢多谢！
我做的是缺氧模型。可是无论组织还是细胞都没有出来过。难道会在提取的过程中都降解了？
BOSS2011 (2013-6-08 10:41:41)
你加氯化钴做个阳性对照吧
你看看抗体说明书上的阳性数据是什么，比如我们用的抗体，说明书上的条带就是Hela细胞用氯化钴处理的蛋白，杂的条带，这样的话就可以看看是你WB的问题还是缺氧体系的问题了。
mamamiya (2013-6-08 10:42:26)
原来有不少园友在做HIF-1 我的课题也是要检测肾脏组织HIF-1的表达情况，看来此指标采用WB是不好做了。。期待有成功的网友能多介绍一些经验。。
mamamiya (2013-6-08 10:42:44)
对了 哪位知道什么公司生产的什么药物 通过给大鼠灌胃可以抑制HIF-1的表达？
pou (2013-6-08 10:43:16)
我这次用了氯化钴250uM作用了4个小时，但是还是没有做出来，郁闷
viviwang1987 (2013-6-08 10:44:06)
我用R D的抗体,做了10几次也没做出来,现在看来可能是抗体不好, 园子里好象有人用novus做出来了.是不是这个抗体好些?
bs4665 (2013-6-08 10:44:26)
我也是做这个抗体的，做了不出，免组也做过了，因为有人说免组相对来说好出一点。问题反应到厂家了，他们去检测抗体效价了，建议楼主还是及时给售后反应问题，不然白白浪费时间啊！
bs4665 (2013-6-08 10:45:00)
相关疾病：
肿瘤
==========================================================================================================
你确信你的蛋白有表达么？
很多情况下，细胞内的hif的mRNA可以很高，但是因为有氧存在下
hif的蛋白很快被降解，所以很多肿瘤细胞在体外培养的时候，WB是杂不出的
如果不是在厌氧培养箱里，一般的要加入适量的氯化钴培养一段时间，会杂出很强的条带的。
其实你也可以这样做个对照啊，用别人已用的细胞系和培养条件，得到细胞总蛋白，或者有纯化的hif蛋白，WB的时候用来做个对照，如果纯化的蛋白都杂不出来，那才是你体系的问题吧。
============================================================================================
想请问一下，如果肿瘤组织中有这个蛋白的表达，在手术取下肿瘤之后，hif-1会不会降解呢？再做wb还能检测到他的表达吗？
pou (2013-6-08 10:45:19)
采用santa-cruz公司分装的HIF-1a的一抗，稀释度1：200，检测糖尿病大鼠肾脏组织HIF-1a的表达情况，结果什么都没有，内参有很好表达，这样至少说明操作、二抗、ECL都没问题吧，现在不知道从何处着手了 ，急。。
pou (2013-6-08 10:45:47)
这个指标 我做免疫组化 快做100张片了还是没出 ：（ 有谁 作出来 指点一下）
fsdd817 (2013-6-08 10:46:14)
我也是做HIF-1 免疫组化和WB 都做了 还是没有出来，请求高人指教呀？
如果哪位大侠有免疫组化和WB的片子的话，能否上传几张给我们正在做HIF-1的战友们欣赏欣赏呢？ 焦急中盼佳音……
987789 (2013-6-08 10:46:33)
我买的博士德的多抗，细胞还是没有厌氧处理的，一次就出来了，条带还挺亮的。首先的看你的蛋白怎么样，转膜后丽春红染一下 看有没有蛋白。自我感觉也没什么特殊注意的地方。转模时间要长点，我半干转一个半小时。
987789 (2013-6-08 10:46:56)
我今年也做HIF-1，还没开始，你们有什麽经验可否传给小妹啊，谢谢啊。
yes4 (2013-6-08 10:51:13)
我也在做这个分子，之前买了milipore的不好用，后又买了novus的还是没有出来，但有一次实验1：100做的出来了微弱的条带，是不是上样量不够，我一般是6ug/lane 的MCF-7细胞，想问一下BD公司的抗体好不好用？
查看全部回复
我也来说两句
