Clonerepetitivesequencesandlentivirallibraries
- StABIlizedirectrepeatsandcreatelentiviralconstructs
- GeneratelentiviralguideRNAlibraries
- RecommendedinCRISPRGeCKOlibraryprotocols
- Chooseelectrocompetentorchemicallycompetentcells
- Highestefficiencycommerciallyavailablecellsforlentiviralcloning: over1×107cfu/µg(chem)or1×1010cfu/µg(electro)
TransformationofEnduraElectrocompetentCellswithGeCKOlentivirallibrariesmayrequireextraRecoveryMedium. OrderextraRecoveryMediumbelow.
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Conserveclonesthatcontainunstablesequences!
MaintainunstableDNA.Lucigen’sEnduraCompetentCellsareacommonlyusedstrainforcloningsequencesthatsufferunwantedrecombinationeventsinotherstrains.Cloneswithinvertedrepeatsorothersequencespronetorecombinationarecommonlyfoundinretroviralgenes,andrequirecellssuchasEnduratobepropagatedstably.
Excellentvalueandefficiency!SwitchtoEnduracellstodayandexperienceahigherlevelofefficiencyandasavingsinyourcloningbudget.
ChemicalorElectrocompetent.Whichevermethodoftransformationyouprefer,Lucigencangiveyoubetterefficiencyand/orbetterprices.
Figure1.Costperreactionofchemicallycompetentcellsofclone-stabilizingstrainsfromothersuppliers.
Figure2.Transformationefficienciesofelectrocompetentclone-stabilizingstrains.
ORDERINFORMATION
Endura™CompetentCellsincludeControlDNAandRecoveryMedium,andarepackagedas SOLOs (1transformationpertube)orDUOs (2transformationspertube)asindicated.EnduraElectrocompetentcellsareprovidedinDUOsformatonly.RecoveryMediumisalsoavailableseparately.ThespecifiedtransformationefficienciesarewithpUCDNA,unlessindicatedotherwise.
PLEASENOTE: Bulkquantities(10timeslargerthanthelargestretailpackagesizebelow)and/orcustompackagingareavailableatveryattractivepricesforallLucigenCompetentCells. PleasecontactLucigen.
NOTE: TransformationofEnduraElectrocompetentCellswithGeCKOlentivirallibrariesmayrequireextraRecoveryMedium. TheZhanglabprotocol(availablefromAddgene)recommends~2mLofRecoveryMediumpertransformation. LucigenEndurakitsprovide1mLofRecoveryMediumpertransformation. OrderextraRecoveryMediumaboveorvisittheRecoveryMediumproductpagehere!
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近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。
关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步骤。
一.混合克隆pool验证
质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞做有限稀释，一般5块板足够。
分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物PCR扩增目的基因片段，与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要，很多杂志投稿时需要这张图，或者有计算突变率的要求。
二.阳性克隆筛选
上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择CruiserTM或者T7EI进行酶切分析，最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。
为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化：
1、尽可能提高单细胞的存活率
a)对于单个细胞很难存活的细胞，如果是贴壁细胞，可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂；而对于悬浮细胞，则推荐采用CellPlaza（共培养的原理），都可以极大的提高细胞的存活率；
b)对于很容易老化的细胞，推荐对细胞进行永生化改造，永生化的方法有很多，这里不做具体推荐。
2、采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒
这样的试剂盒，市面上也比较多，但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒，建议选择Qiagen或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌，Genloci这家公司是主要做基因重组的，所以，他们开发的一些产品针对性比较强，而且价格便宜，建议优先使用。
3、设计合理的引物和选用高保真的Taq酶
引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处，或者上游200bp和下游100bp处，这样的好处是后面进行酶切分析的时候，对于阳性的克隆，可以很容易观察到2条分开的条带。
Taq酶，建议是用NEB的Fusion或者Q5，毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失，所以，高保证是必要的，防止产生假阳性的结果。
4、选择高特异性的错配酶
目前用的比较多的是CELI和T7EI两种酶，CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品，价格较贵，货期较长；CruiserTM价格合适，同时货期短，国内可以2-3天内到货，做到真正质优价廉。
T7EI是NEB的产品，最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外，还可以识别十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA，正是因为这个特点，很容易导致假阳性的现象。
测序公司往往是比较容易忽略的一个环节，很多人送测序后，拿到的测序结果经常发现没信号，就认为是自己的样品有问题，而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式，测序是苦力活，人员流动比较大，所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好，实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以，一定要找一些资质比较好的测序公司，同时，发现问题的时，可以考虑换一家公司再测一遍。
大家好，我是CRISPR新手。在设计一个白蛋白基因相关的sgRNA，但是白蛋白的序列有17多kb，很多设计工具都无法导入。请问大家我这个问题该怎么解决呀？？
问下各位大神，用在线设计的软件找PAM后，还需要找functiondomains，从而排除一些PAM吗？有没有一些比较好的在线设计网站。
科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术
这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。
那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？
CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。
也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。
尽量简洁
http://www.addgene.org/crispr/guide/
我想问一个基础问题啊，用CRISPR/cas系统敲除某个基因后，如果突变株表型没法通过肉眼分辨，怎么把突变株找出来？要用到什么Marker吗？还是需要对细胞逐个测序检测？
如果是逐个检测，那就涉及到效率问题了，当效率比较低的时候，岂不是工作量很大？
还有cas9基因会残留在细胞里吗？
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