用于基因传输的HVJ脂质体和HVJ包装载体的制备

材料

试剂

BSS(缓冲盐溶液）

137mmol/LNaCl

5.4mmol/LKCl

10mmol/LTris-HCl(pH7.6)

将8gNaCl、0.4gKCl和I.21gTris碱溶解在蒸馏水中，用lmol/L盐酸调节pH至7.6,再用蒸馏水定容到1L。高压灭菌，4°C储藏。

牛脑磷脂酰丝氨酸钠胆盐（PS),色谱纯（AvantiPolarLipidsInc.)

氯仿（Sigma-Aldrich)

胆固醇（Sigma-Aldrich)

DC-胆固醇（AvantiPolarLipidsInc.)

DMSO(二甲亚砜）（Sigma-AWrich)

DOPE(1，2-二油酰磷脂酰乙醇胺）（Sigma-Aldrich)
从HVJ(Z系，VR-105,ATCO而来的HVJ种子
将HVJ最好的种子保存在10%的DMSO中，100ul分装。

氮气

磷酸盐缓冲液（PBS)

从鸡蛋黄中提取的卵磷脂（PC)(Sigma-Aldrich)

质粒DNA

柱色谱纯化质粒DNA，溶于TE(tog/ml)缓冲液，BSS或水中，保存在一20℃。DNA的终浓度应该大于lmg/ml。

多聚蛋白胨溶液

1%多聚蛋白胨（酪蛋白的胰腺消化物；Wako,Osaka,Japan)

0.2%NaCl(pH7.2)

将5g多聚蛋白胨和IgNaCl溶解在蒸馏水中，用lm〇l/LNaOH溶液调整PH至7.2,再用蒸馏水定容到500ml,高压灭菌后4°C储藏。

硫酸鱼精蛋白（lOmg/ml,溶于PBS中）

鞘鱗脂（Sigma-Aldrich)

蔗糖梯度溶液

将150g和300g蔗糖分别溶于BSS中，再用BSS定容到500ml,高压灭菌后4℃储藏，获得

30%和60%(m/V)的蔗糖溶液。

Tris-EDTA(TE)

10mmol/LTris-Cl(pH8.0)

lmmol/』LEDTA

TritonX-IOO(2%,溶于TE溶液中）

仪器

醋酸纤维素滤膜（〇.45um和0.2〇um)(Nalgene)

离心机（J2-HS)，含JA-20的转子和35ml离心管
（BeckmanInstruments)

低速离心机（05PR-22，Hitachi,Tokyo，Japan)

分离柱（不含内霉素，用于制备质粒DNA)(QIAGEN)

塑料离心管（50ml)(Becton-Dickinson)

玻璃管（24mm口径，12cm长）（Fujiston24/40，IwakiClassCaLtd，Tokyo,Japan)

这些玻璃管可以定做，也可使用类似抗氯仿腐蚀的灭菌管。新管在使用前在饱和的KOH-乙醇溶液中浸泡24h,用蒸馏水清洗后，180°℃下加热2h。

分光光度仪（DU-68，BeckmanInstruments)

旋转蒸发仪（型号SR-65〇，TokyoRikakikaiInc.，Tokyo，Japan)

超速离心机，带RPS-40T转子（55P-72，Hitachi)
超速离心机管（12ml)(Hitachi)

紫外交联仪（SpectrOlinkerXL-1000，SpectronicsCo.)

带压力表的真空泵（Asp——13型，IwakiGlassCo.Ltd.，Tokyo，Japan)

方法

在即将孵出小鸡的鸡蛋中制备HVJ

1•将HVJ病毒种子迅速解冻，然后用多聚蛋白胨溶液按1:1000的比例稀释。将稀释后的种子保存在4°C,直到开始下一步实验。

2.室温条件下，在黑室中用光照观察鸡胚，在绒毛尿囊膜上方约0.5mm处标记上一个注射的点，用碘酊消毒后在标记处穿刺。

3•用带26号针头的Iml无菌注射器将0.Iml稀释的病毒种子注射人每个鸡蛋中。将针头垂直插入以便刺破绒毛尿囊膜。

4•接种病毒种子之后，将鸡蛋上由于注射所形成的洞用融化的石蜡覆盖，在36.5°C和充足的湿度条件下培养鸡蛋4d。在收获病毒之前要将鸡蛋在4°C下预冷至少6h。

5.收获病毒：剥去一部分鸡蛋壳，用带18号针头的IOml注射器将绒毛尿囊膜胚液转移到灭菌瓶中，4°C保存，避免结冰。

这一步可以在室温条件下完成，病毒在液体中可以稳定存在3个月。

绒毛尿囊膜胚液HVJ的纯化

6.将200ml绒毛尿囊膜胚液分装到4个50ml锥形离心管中，用低速离心机在4°C,3000r/min(IOOOgO离心lOmin。

7•将上清分装在6个离心管（BeckmanJ&20)中，在4°C，15000r/min(27OOOg)离心30min。

8.在每个离心管的沉淀中加入5mlBSS，在4°C条件下过夜。

9.轻轻地将沉淀重悬浮，悬液分装在两个离心管中，按步骤6的设置离心。

10.再在每管中加人5mlBSS，在4°C条件下培养8h以上。

11.轻轻重悬沉淀，4°C,3000r/min(IOOOg)离心15min。将上清转移到一个无菌管中，4°C保存。

12.将上清稀释10倍后，用分光光度计在540nm处测量吸光度来确定病毒的浓度。

HVJ可以利用紫外交联仪在99mjoules/cm2的强度照射下灭活。

在540nm处的一个光学密度单位与15〇〇〇个红血球凝聚单位相当，而红血球凝聚单位可以反映融合的活性。按照上述方法制备的上清通常显示20000〜30000HAU/mL。无菌制备的病毒溶液可以保持融合活性3个星期，用紫外照射灭活的HVJ可以保存在10%的DMSO中，在一80°C或一170°C(液氮中）活性可以保持超过6个月。

脂类复合物的制备

13•将DOPE(12.2mg)、鞘磷脂（11.5mg)、胆固醇（23.8mg)溶于387〇ul氯仿中，制备脂类溶液；将IOOmgPC溶解在Iml氯仿中，取130ul与3870ul脂类溶液混合。

制得的4OOOul混合物称为脂质体的基本混合物，更高级的混合物被用来制备阴离子或阳离子脂质体（如下所示），或者氮气下一20°C保存。

14.阴离子脂质体混合物的制备：加入IOmg的PS到上述基本混合物中去；阳离子脂质体的制备：加人6mg的DC-胆固醇到上述基本混合物中去。

15•将得到的脂类溶液分装到8个玻璃管中，每管含0.5ml，其中包括8.8mg脂类物质，把这些玻璃管置于冰上或者氮气中一20°C保存，直到挥发溶剂之前。

脂类溶液应该尽快将其中的溶剂挥发。

16.将玻璃管连接到旋转蒸发仪上，将玻璃管的端部浸没在40°C的水浴中，在真空条件下蒸发有机溶剂5〜lOmin。

适合于做脂质体的脂类物质是那些紧贴在玻璃管内壁上并形成薄层的，沉积在管底部的脂类物质则并不合适。将得到的脂类物质在氮气中一20℃保存，有效期为1个月。

HVJ载体的制备和输送

17•用于融合介导基因转染的HVJ载体的制备
含DNA的HVJ脂质体的制备（图2)

a.将质粒DNA(200M中含有200/ig的DNA)加入到一玻璃管的脂类混合物中(步骤16),涡旋振荡30s，接着在37°C中培养30s。如此循环8次。

用这种方法，质粒DNA(最大20kb)能够以10%〜30%的效率被阴离子脂质体包裹，或者以50%〜60%的效率被阳离子脂质体包裹。

b.将脂质体悬液通过〇.45um孔径的醋酸纤维素滤膜，再通过孔径为〇.2um的膜，获得粒径均一的脂质体。

使用带有聚碳酸酯滤膜的挤出机制备脂质体得到的粒径更均一。

c•加人15OOOHVU的紫外灭活HVJ病毒到脂质体悬液中，将玻璃管置于冰上5〜IOmin,然后在恒温37°C的振荡水浴锅（速率120/min)中培养lh。

d.在离心管中先加人Iml60%的蔗糖溶液，再加人7ml30%的蔗糖溶液，在其上覆盖HVJ-脂质体混合物，最后用BSS将离心管装满。

e.用蔗糖梯度离心的方法分离HVJ-脂质体复合物和HVJ，在4°C,62OOOg的条