脂质体介导的真核细胞转染实验一哺乳动物细胞的选择标记_蚂蚁淘，【正品极速】生物医学科研用品轻松购|ebiomall -蚂蚁淘商城

商品列表技术文章相关问答

当前位置： > 首页 > 技术文章 >

脂质体介导的真核细胞转染实验一哺乳动物细胞的选择标记

来自 : mayitao

实验材料	哺乳动物
实验步骤	一、腺苷脱氨酶（ADA） 1. 选择条件：培养液中加10μg/ml 胸腺嘧啶脱氧核苷，15μg/ml 次黄嘌呤，4μmol/l腺嘌呤-9-β-D-呋喃木糖苷（Xyl-A），及0.01~0.3μmol/l2‘-脱氧助间型霉索（dCF）。胎牛血清中含有ADA可解除培养液的毒性，所以在用前才加入培养液中。 2. 选择原理：Xyl-A可转化成Xyl-ATP并掺入核酸中，从而导致细胞死亡。Xyl-A被ADA解毒成为其肌苷衍生物，dCF是ADA过渡态类似物，因而可以灭活母代细胞内源性的ADA，内源性ADA的水平因细胞不同而异，因此dCF的合适选择浓度也随之变化。 3. 说明：对于内源性ADA平高的细胞，转染的ADA基因必须高表达才行。现已有ADA缺陷的CHO细胞可供应用。通过提高dCF的水平，ADA可用于扩增系统二、氨基糖苷磷酸转移酶（neo，G418，APH） 1. 选择条件：含100~800μg/mlG418的完全培养液。G418应配制于高缓冲能力的溶液中，以使加入该药物后不至干改变培养液的pH值。 2. 选择原理：G418通过干扰核糖体的功能而阻断哺乳动物细胞的蛋白合成，它是一种氨基糖苷，在结构上与新霉素，庆大霉素及卡那霉素相似。因此在哺乳动物细胞中表达细菌的APH基因《来源于105〉可解除G418的毒性。 3. 说明：应试验不同浓度的G418，因为各种细抱被G418杀死的敏感性不同。许多研究者购买大量同一枇号的G413，因为不同批号药物之间的药效可能不同。在致死剂量的G418存在下，细胞还能分裂1~2次，因此该药的效果需要几天才能变得明显。三、二氢叶酸还原酶（DHFR） 1. 选择条件：α-培养液中加0.01~300μmol/l氨甲蝶呤（MTX）及透析过的胎牛血清。 2. 选择原理：DHFR对于嘌呤的生物合成是必不可少的。因此，在无外源性嘌吟存在时它对细胞生长是必需的。透析血清以除去内源性的核苷，并采用无核苷的培养液，这些对于选择都是必要的。MTX是DHFR的竞争性抑制剂，因此增加的MTX浓度可以选择DHFR的高表达。 3. 说明：对于内源性DHFR水平高的细胞，需要极高水平地表达被转染的正常DHFR基因才能进行选择。已有一种突变的尺基因，其编码的酶对MTX有抗性，因而在大多数细胞中能用来做显性选择，采用DHFR缺陷的细胞时，DHFR可用来扩增被转染的基因。四、潮霉衆B磷醱转移酶（HPH） 1. 选择条件：含有10~400μg/ml潮霉素B的完全培养液。 2. 选箨原理：潮霉素B是一种氨基环多醇，通过破坏转位及促进错译而抑制蛋白质的合成。HPH基因通过磷酸化作用而解除潮霉素B的毒性。 3. 说明：HPH基因只是近几年来才用于哺乳动物细胞系统。并且，能有效表达该基因的载体尚未广泛流传，虽然用于选择的潮霉素B浓度可在10~400μg/ml之间变化，但许多细胞需用的浓度为200μg/ml。五、胸苷激酶（TK） 1. 选择条件：正向选择，完全培养液中加100mmol/l次黄嘌呤0.4μmol/l氨基喋呤，16μmol/l胸苷及3μmol/l甘氨酸。反向选择，完全培养液中加30μg/ml5-溴脱氧尿苷（BUdr）。 2. 选择原理：在正常生长条件下，细胞并不需要胸苷激酶，因为合成dTTP的通常途径是通过dCDP。在培养液中加BUdr将杀死TK⁺细胞，因为BUdr被TK磷酸化之后可掺入DNA中。用HAT培养液选择TK⁺细胞主要是由于氨基蝶呤的存在能阻断dCDP变成3dTDP。这样，细胞就需要胸苷激酶从胸苷来合成dTTP。 3. 说明：因为有正向及反向选择条件，胸苷激酶得到了广泛的应用，与ADA及DHFR不同的是，无法对不同的TK表达水平的细胞进行选择，因此该基因不能用于基因扩增。与ADA及DHFR相同的是，许多哺乳动物细胞都能表达TK，使得在这些细胞中不能用该标记基因，除非用BUdr选择出TK^-突变株。六、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核耱转移酶（XGPRT，gpt） 1. 选择条件：培养液中含有透析过的胎牛血请，250μg/ml黄嘌呤，15μg/ml次黄嘌吟，10μg/ml胸苷，2μg/ml氨基蝶呤，25μg/ml霉酚酸及150μg/mlL-谷氨酰胺。 2. 选择原理：氨基蝶呤及霉酚酸都可以阻断GMP合成的全途径。XGPRT的表达使细胞能从黄嘌呤合成GMP，因而细胞能在含有黄嘌呤但不含鸟嘌呤的培养液中生长。因此有必要用透析过的胎牛血清及无鸟嘌呤的培养液。 3. 说明：XGPRT是在哺乳动物中无同源物的细菌来源的酶，因而可在哺乳动物细胞中用作显性选择标记。用于选择的霉酚酸的用量因细胞而异，能通过有鸟嘌呤存在或无其存在时进行滴定而测定。

实验材料

实验步骤

一、腺苷脱氨酶（ADA）

1. 选择条件：培养液中加10μg/ml 胸腺嘧啶脱氧核苷，15μg/ml 次黄嘌呤，4μmol/l腺嘌呤-9-β-D-呋喃木糖苷（Xyl-A），及0.01~0.3μmol/l2‘-脱氧助间型霉索（dCF）。胎牛血清中含有ADA可解除培养液的毒性，所以在用前才加入培养液中。

2. 选择原理：Xyl-A可转化成Xyl-ATP并掺入核酸中，从而导致细胞死亡。Xyl-A被ADA解毒成为其肌苷衍生物，dCF是ADA过渡态类似物，因而可以灭活母代细胞内源性的ADA，内源性ADA的水平因细胞不同而异，因此dCF的合适选择浓度也随之变化。

3. 说明：对于内源性ADA平高的细胞，转染的ADA基因必须高表达才行。现已有ADA缺陷的CHO细胞可供应用。通过提高dCF的水平，ADA可用于扩增系统

二、氨基糖苷磷酸转移酶（neo，G418，APH）

1. 选择条件：含100~800μg/mlG418的完全培养液。G418应配制于高缓冲能力的溶液中，以使加入该药物后不至干改变培养液的pH值。

2. 选择原理：G418通过干扰核糖体的功能而阻断哺乳动物细胞的蛋白合成，它是一种氨基糖苷，在结构上与新霉素，庆大霉素及卡那霉素相似。因此在哺乳动物细胞中表达细菌的APH基因《来源于105〉可解除G418的毒性。

3. 说明：应试验不同浓度的G418，因为各种细抱被G418杀死的敏感性不同。许多研究者购买大量同一枇号的G413，因为不同批号药物之间的药效可能不同。在致死剂量的G418存在下，细胞还能分裂1~2次，因此该药的效果需要几天才能变得明显。

三、二氢叶酸还原酶（DHFR）

1. 选择条件：α-培养液中加0.01~300μmol/l氨甲蝶呤（MTX）及透析过的胎牛血清。

2. 选择原理：DHFR对于嘌呤的生物合成是必不可少的。因此，在无外源性嘌吟存在时它对细胞生长是必需的。透析血清以除去内源性的核苷，并采用无核苷的培养液，这些对于选择都是必要的。MTX是DHFR的竞争性抑制剂，因此增加的MTX浓度可以选择DHFR的高表达。

3. 说明：对于内源性DHFR水平高的细胞，需要极高水平地表达被转染的正常DHFR基因才能进行选择。已有一种突变的尺基因，其编码的酶对MTX有抗性，因而在大多数细胞中能用来做显性选择，采用DHFR缺陷的细胞时，DHFR可用来扩增被转染的基因。

四、潮霉衆B磷醱转移酶（HPH）

1. 选择条件：含有10~400μg/ml潮霉素B的完全培养液。

2. 选箨原理：潮霉素B是一种氨基环多醇，通过破坏转位及促进错译而抑制蛋白质的合成。HPH基因通过磷酸化作用而解除潮霉素B的毒性。

3. 说明：HPH基因只是近几年来才用于哺乳动物细胞系统。并且，能有效表达该基因的载体尚未广泛流传，虽然用于选择的潮霉素B浓度可在10~400μg/ml之间变化，但许多细胞需用的浓度为200μg/ml。

五、胸苷激酶（TK）

1. 选择条件：正向选择，完全培养液中加100mmol/l次黄嘌呤0.4μmol/l氨基喋呤，16μmol/l胸苷及3μmol/l甘氨酸。反向选择，完全培养液中加30μg/ml5-溴脱氧尿苷（BUdr）。

2. 选择原理：在正常生长条件下，细胞并不需要胸苷激酶，因为合成dTTP的通常途径是通过dCDP。在培养液中加BUdr将杀死TK⁺细胞，因为BUdr被TK磷酸化之后可掺入DNA中。用HAT培养液选择TK⁺细胞主要是由于氨基蝶呤的存在能阻断dCDP变成3dTDP。这样，细胞就需要胸苷激酶从胸苷来合成dTTP。

3. 说明：因为有正向及反向选择条件，胸苷激酶得到了广泛的应用，与ADA及DHFR不同的是，无法对不同的TK表达水平的细胞进行选择，因此该基因不能用于基因扩增。与ADA及DHFR相同的是，许多哺乳动物细胞都能表达TK，使得在这些细胞中不能用该标记基因，除非用BUdr选择出TK^-突变株。

六、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核耱转移酶（XGPRT，gpt）

1. 选择条件：培养液中含有透析过的胎牛血请，250μg/ml黄嘌呤，15μg/ml次黄嘌吟，10μg/ml胸苷，2μg/ml氨基蝶呤，25μg/ml霉酚酸及150μg/mlL-谷氨酰胺。

2. 选择原理：氨基蝶呤及霉酚酸都可以阻断GMP合成的全途径。XGPRT的表达使细胞能从黄嘌呤合成GMP，因而细胞能在含有黄嘌呤但不含鸟嘌呤的培养液中生长。因此有必要用透析过的胎牛血清及无鸟嘌呤的培养液。

3. 说明：XGPRT是在哺乳动物中无同源物的细菌来源的酶，因而可在哺乳动物细胞中用作显性选择标记。用于选择的霉酚酸的用量因细胞而异，能通过有鸟嘌呤存在或无其存在时进行滴定而测定。

免责声明本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。

发布于： 2019-01-07 阅读（99）

下一篇 : 如何与「心机」boy 和睦相处？实验室离心机安全必备知识

▍ 相关分类

缓冲液

酸碱缓冲液上样缓冲液电泳缓冲液其它缓冲液

生物分子