Note: The product is for research use only, not for use in diagnostic or therapeutic procedures |
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Product Name | Smad3 TFact™ DNA-Binding ELISA |
Assay Type | DNA-Binding ELISA |
Sub Type | None |
Detection Method | Colorimetric 450 nm |
Synonyms | JV15-2; MAD-3; MADH3; Mad3; Mothers against DPP homolog 3; Mothers against decapentaplegic homolog 3; SMAD 3; Smad 3 |
Specificity | The TFact™ Smad3 DNA-Binding ELISA detects endogenous levels of total Smad3 protein. |
Storage/Stability | 4°C/6 Months |
NCBI Gene Symbol | SMAD3 |
Database Links |
Gene ID: 4088 UniProt ID: P84022 OMIM #: 114500/603109 Unigene #: HS.36915 |
Application Images | |
Image Legend |
The TFact™ Smad3 DNA-Binding ELISA Kit detects active Smad3 in Jurkat and HepG2 Nuclear Extract. The Jurkat and HepG2 cells were grown 3 days in RPMI 1640 and DMEM with 10% FBS and harvested for nuclear extract. |
AssayBiotechnology公司成立于2006年,位于美国洛杉矶。AssayBiotechnology公司有超过六千种抗体,涵盖了各种研究和应用领域。另外,AssayBiotechnology公司还拥有一千多种磷酸化抗体,同时公司正努力生产所有人类genowide抗体,针对到2015年为止出版过的调控磷酸化位点的抗体。作为可靠的高质量抗体生产商,AssayBiotechnology公司拥有多年研发经验的高级科学家确保了公司抗体的高品质,高特异性,100%的保证抗体质量。
AssayBiotechnology公司利用主要由混合抗原均一化技术和人类cDNA/EST噬菌体表面呈现文库技术两项具有自主知识产权的专有技术组成抗人类蛋白单克隆抗体大规模开发生产平台,完美地解决了传统的单克隆抗体生产耗时过长及成本过高的瓶颈。AssayBiotechnology公司可在较短的时间内将剩余的抗人类基因编码蛋白质单克隆抗体开发完,从而建立世界上第一个与人类基因库相配套的抗人类蛋白单克隆抗体库和抗原库(该抗体库和抗原库与国际上通用的GenBank相链接),并建成全球种类最多和规模最大的抗人类蛋白单克隆抗体生产体系和销售中心。
与人类基因相联系的抗体蛋白与抗原蛋白信息是有限的,并且每一个抗体与抗原蛋白相关信息都是唯一的和不可复制的,和人类基因组计划一样,谁先开发出来谁就拥有垄断优势。AssayBiotechnology公司开发出抗体库和抗原库之后,将对每一个新发现的和有价值的抗体与抗原信息申请专利保护,以后所有应用到这些抗体与抗原信息的需求者(例如药物靶点筛选)都必须向AssayBiotechnology公司购买使用许可,因而这是最新生命科学领域的战略高地。
自2006年1月成立以来,AssayBiotechnology一直是行业*的抗体生产和工程及分析技术,荧光染料,淬灭剂,重组蛋白和合成肽的全球贡献者。我们位于加利福尼亚州旧金山湾区的中心地带,致力于满足全球对医疗和学术研究中使用的高质量检测试剂盒和免疫试剂的需求,这些试剂主要构成医疗保健的基础。详细产品列表:AssayBiotech全国代理 货号产品规格OK-01004-1BB-R(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0101BD-1(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0102BD-2(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0103BD-3(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0104BD-4(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0105Betacellulin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0106beta-NGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0107BMP-2(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0108CNTF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0109CTGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0110CXCL-16(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0111EGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0112EG-VEGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0113Eotaxin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0114Eotaxin-3(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0115FGF-Basic(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0116Follistatin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0117G-CSF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0118GM-CSF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0119GRO/MGSA(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsA000114-3-3zeta(Phospho-Ser58)Antibody50ulA0002ADD1(Phospho-Ser726)Antibody50ulA0003AMPKalpha1/2(Phospho-Thr183/172)Antibody50ulA0004AmyloidbetaA4(Phospho-Thr743/668)Antibody50ulA0005CaMK2alpha/beta/delta(Phospho-Thr305)Antibody50ulA0006CREB(Phospho-Ser142)Antibody50ulA0007DARPP-32(Phospho-Thr75)Antibody50ulA0008EGFR(Phospho-Thr678)Antibody50ulA0009EGFR(Phospho-Thr693)Antibody50ulA0010EFNB1/2(Phospho-Tyr330)Antibody50ulA0011GABA-RB(Phospho-Ser434)Antibody50ulA0012GSK3alpha/beta(Phospho-Tyr279/216)Antibody50ulA0013HSP90B(Phospho-Ser254)Antibody50ulA0014IkappaB-beta(Phospho-Ser23)Antibody50ulA0015IkappaB-epsilon(Phospho-Ser22)Antibody50ulA0016Keratin18(Phospho-Ser33)Antibody50ulA0017Keratin8(Phospho-Ser73)Antibody50ulA0018MAPKAPK2(Phospho-Thr334)Antibody50ulA0019MEF2A(Phospho-Ser408)Antibody50ulA0020Myc(Phospho-Ser62)Antibody50ul
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1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃ 过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。
5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
间接法
1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜;
2.次日洗涤3次;
3.加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;
4.(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分钟,洗涤;
6.’最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
目前,我用该蛋白的鼠源性单抗来包被ELISA板子,5%BSA37度封闭二小时后,洗涤四次后将板子分三个组加入抗原:其中一个组中加入的是我重组的蛋白,另一个组为用其它方法证实含该蛋白的人体内血清,最后一个组加入PBS。37度一小时后洗涤四次后每孔加入我制备的兔源性多抗。37度一小时洗涤六次后我再加入酶标记的抗兔的抗体37度40分钟后洗涤六次后TMB显色。
问题就在我显色后所有的孔都是阳性,其中以抗原为我的重组蛋白组与PBS组OD值最高,两组都可以达到1.8以上,而加入的抗原为人体血清组低,为0.6-1.0不等。
后面我优化条件,封闭液用过5%的脱脂奶粉,2%的BSA,包被的单抗浓度摸了梯度,加入的多抗也摸了梯度,酶标的抗体也摸了梯度。结果都没有改变,连趋势每次都是一样以重组蛋白组与PBS组OD最高。
今天我还试着把抗原换成其它蛋白也做出了强阳性?
请教各位高手,我的ELISA该如何往下面做了啊,是不是我的抗体本身有问题呢?
对了,我包被用的单抗是用GE公司的预装柱纯化的,很纯,在考染中是看不到一条杂带的。
1. 包被:用0.05M PH9,碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml,37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
方法二:用于检测未知抗体的间接法:
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30~60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
我现在用商品化的试剂盒进行夹心法ELISA测定某抗体的浓度,盒子给定了4个标准品,标准品抗体浓度为70000~1000单位,测定步骤中要求对样品进行1:1000稀释后测定。
但是有的样本按照1:1000稀释后,最终OD值大于70000浓度的标准品的OD值,然后使用ELISACALC软件进行四参数拟合,超过了标准曲线的范围,就算不出来这个样品的浓度,但是如果在1000-70000之间的OD值就可以算出相应浓度。请教大神们,接下来我是否可以对样品进行1:2000,1:4000浓度稀释,算出结果后再×2、×4,算作此样品的浓度呢?还是直接给一个>70000的定性结果?或者可以有能算出来的其他软件?
Ps试剂盒中提及Dilutionlinearity(稀释线性?)为141%,这个是什么意思呢?
多谢!!
大家好,我在做双抗夹心法的elisa实验,已经花了20来天了,然而标准曲线的线性一直做不好,而且不稳定。下面我把具体的实验过程说下,希望大家能给我提个建议,谢谢!
首先我从以下数据中确定了标准品的起始稀释浓度:4.64,46.4,464,4640IU/ml对应的OD为0.55,1.178,1.086,1.168.因此我取46.4IU/ml(300ng/ml)作为标品的起始稀释浓度。然后作了关于单抗,多抗,二抗的合适稀释度的实验,我的数据如下:
123456789
空白0.2290.1920.2120.1540.1390.1730.2360.1770.257
46.4iu/ml1.2421.5271.2691.9641.6281.9592.0051.8802.163
9.28iu/ml0.9680.9501.0131.1360.8731.2461.6971.5861.769
阴性0.1920.1760.2500.1310.1610.1540.1990.2190.244
选取了7号组合单抗,多抗,二抗分别为1ug/ml,1ug/ml,0.5ug/ml。
标品按照以下梯度稀释:46.423.211.65.82.91.450.725iu/ml.以下是我近来做的三组数据,都是相对空白的相对值:
123
46.4iu/ml0.6130.5860.851
23.20.5240.6490.765
11.60.3820.510.663
5.80.3160.3850.567
2.90.2880.3190.37
1.450.2890.1340.303
0.7250.1210.1460.113
空白0.0820.0870.101
阴性0.0820.1050.101
似乎梯度都不明显。我现在疑惑的是我的标品浓度的设置有问题还是之前抗体的浓度选择不合适,请大家多指点,万分感谢!!!
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